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γ-谷an酸激酶(γ-GK)试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-28

简要描述:

γ-谷an酸激酶(γ-GK)试剂盒,微板法
γ-谷*酸激酶(γ-GK,EC 2.7.2.11)是脯*酸生物合成途径中的关键酶之一。催化由谷*酸生成脯*酸途径的第一步反应。

γ-谷an酸激酶(γ-GK)试剂盒,微板法

γ-谷an酸激酶(γ-GK)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 γ-谷*酸激酶(γ-GK)酶活测定试剂盒说明书 (货号:WS5011W 微板法 48 样) 一、产品简介: γ-谷*酸激酶(γ-GKEC 2.7.2.11)是脯*酸生物合成途径中的关键酶之一。催化由谷*酸生成脯*酸途径的第一步反应。 本试剂盒利用γ-GK 催化谷*酸磷酸化,进一步与转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸,在酸性条件下与 Fe3+形成 Hydroxamate-Fe3+复合物 ,通过检测该复合物在 535 nm 波长处的 OD 值,进而得出γ-GK 酶活力大小。该酶催化的反应方程式:ATP+L-glutamate=ADP+L-glutamate 5-phosphate二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 液体 5mL×1 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下,使粉体落到底部, 再加入 6mL 蒸馏水溶解备用。 试剂三 液体 5mL×1 4℃保存 试剂四 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下,使粉体落到底部, 再加入 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂五 液体 10mL×1 4℃保存 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、γ-谷*酸激酶(γ-GK)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样本情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、 样本制备: ① 组织样本: 取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆,12000rpm4℃离心 10min,取上清液待用。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 ③ 液体样本:澄清的液体样本直接检测,若浑浊则离心后取上清检测。 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 540nm② 所有试剂解冻至室温。 ③ 在 EP 管中依次加入: 试剂(μL测定管 对照管 样本 50 50 试剂一 50 40 试剂二 50 50本试剂盒仅供科研使用 2 试剂三 50 50 试剂四 10 混匀,37℃水浴 60min 试剂五 100 100 混匀,反应 2min 后,8000rpm4℃离心 10min,取 200μL 上清液于 96 孔板中,535nm 处分别读取吸光值 AA=A 测定管-A 对照管(每个测定管须设一个对应的对照管)。 【注】若ΔA 的值在零附近徘徊,则可加大样本量 V1(如增至 80μL,则试剂一相应减少),则 改变后的加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白在每小时内催化产生 1 nmol 谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为 一个酶活力单位。 γ-GK 活性(nmol/h/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=480×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织在每小时内催化产生 1 nmol 谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为一个酶 活力单位。 γ-GK 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=480×ΔA÷W 3细菌/细胞数量计算: 单位定义:每 104个细胞在每小时内催化产生 1 nmol 谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为一 个酶活单位(U)。 γ-GK 活性(nmoL/min /104 cell)= [ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.96×A 4、液体中酶活力的计算: 单位定义:每毫升液体在每小时内催化产生 1 nmol 谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为一个 酶活力单位。 γ-GK 活性(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1÷T=480×ΔA V---提取液体积,1mLV1---加入反应体系中样本体积,0.05mLV2---反应体系总体积:3×10-4 Ld---96 孔板光径,0.5cmT---反应时间,60min=1hW---样本质量,gε---摩尔消光系数,2.5×104 L/mol/cmCpr----样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。

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