γ-谷an酸激酶(γ-GK)试剂盒,微板法

γ-谷an酸激酶(γ-GK)试剂盒,微板法

γ-谷an酸激酶(γ-GK)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 γ-谷*酸激酶（γ-GK）酶活测定试剂盒说明书 （货号：WS5011W 微板法 48 样） 一、产品简介： γ-谷*酸激酶(γ-GK，EC 2.7.2.11)是脯*酸生物合成途径中的关键酶之一。催化由谷*酸生成脯*酸途径的第一步反应。 本试剂盒利用γ-GK 催化谷*酸磷酸化，进一步与转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与 Fe3+形成 Hydroxamate-Fe3+复合物 ，通过检测该复合物在 535 nm 波长处的 OD 值，进而得出γ-GK 酶活力大小。该酶催化的反应方程式：ATP+L-glutamate=ADP+L-glutamate 5-phosphate。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 5mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下，使粉体落到底部， 再加入 6mL 蒸馏水溶解备用。 试剂三 液体 5mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉体 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下，使粉体落到底部， 再加入 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂五 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、γ-谷*酸激酶（γ-GK）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样本情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、 样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清液待用。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测，若浑浊则离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm。 ② 所有试剂解冻至室温。 ③ 在 EP 管中依次加入： 试剂（μL） 测定管 对照管 样本 50 50 试剂一 50 40 试剂二 50 50本试剂盒仅供科研使用 2 试剂三 50 50 试剂四 10 混匀，37℃水浴 60min 试剂五 100 100 混匀，反应 2min 后，8000rpm，4℃离心 10min，取 200μL 上清液于 96 孔板中，535nm 处分别读取吸光值 A，△A=A 测定管-A 对照管（每个测定管须设一个对应的对照管）。 【注】若ΔA 的值在零附近徘徊，则可加大样本量 V1（如增至 80μL，则试剂一相应减少），则 改变后的加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白在每小时内催化产生 1 nmol 谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为 一个酶活力单位。 γ-GK 活性(nmol/h/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=480×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织在每小时内催化产生 1 nmol 谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为一个酶 活力单位。 γ-GK 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=480×ΔA÷W 3、按细菌/细胞数量计算： 单位定义：每 104个细胞在每小时内催化产生 1 nmol 谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为一 个酶活单位（U）。 γ-GK 活性(nmoL/min /104 cell)= [ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.96×△A 4、液体中酶活力的计算： 单位定义：每毫升液体在每小时内催化产生 1 nmol 谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为一个 酶活力单位。 γ-GK 活性(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1÷T=480×ΔA V---提取液体积，1mL； V1---加入反应体系中样本体积，0.05mL； V2---反应体系总体积：3×10-4 L； d---96 孔板光径，0.5cm； T---反应时间，60min=1h； W---样本质量，g； ε---摩尔消光系数，2.5×104 L/mol/cm； Cpr----样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。