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1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-28

简要描述:

1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)试剂盒,微板法
Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物体内脯*酸生物合成的关键酶,同时也是植 物在遭受胁迫时脯*酸合成的限速酶;脯*酸作为一种渗透调节物质,与植物对干旱和 盐胁迫的适应性密切相关。

1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)试剂盒,微板法

1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)试剂盒说明书 (货号:WS4011W 微板法 48 样) 一、产品简介: Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物体内脯*酸生物合成的关键酶,同时也是植 物在遭受胁迫时脯*酸合成的限速酶;脯*酸作为一种渗透调节物质,与植物对干旱和 盐胁迫的适应性密切相关。所以 P5CS 在调节脯*酸的代谢水平上具有重要作用。 Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)催化谷*酸转化成γ-谷*酸半醛,同时使 NADPH 氧化成 NADP+,通过检测 NADPH 340nm 处的下降速率,即可得出 P5CS 酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下,使粉体落到底部, 再加入 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 粉体 mg×2 -20℃保存 临用前甩几下,使粉体落到底部, 每支分别加0.6mL 用,用不完的试剂分装后 蒸馏水溶解备 -20℃存,禁止反复冻融,三天内用完。 试剂三 液体 13mL×1 4℃保存 试剂四 粉体 mg×2 4℃保存 临用前甩几下,使粉体落到底部, 再加入 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样本情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、 样本制备: ① 组织样本: 取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆,12000rpm4℃离心 10min,取上清液待用。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取 ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 ③ 液体样本:澄清的液体样本直接检测,若浑浊则离心后取上清检测。 2、 上机检测: 1 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm2 所有试剂解冻至室温。 3 制备对照管样本:取出同一个样本的部分上清液至一新 EP 管中,于 95℃水浴中煮沸 10min 后取出,冷却至室温后于 12000rpm4℃或者室温离心 10min,取离心后的上 清液作为该样本的对照管样本备用。 4 96 孔板中依次加入:本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 40 40(煮沸的样本) 试剂一 10 10 试剂二 10 10 试剂三 130 130 试剂四 10 10 混匀,室温(25℃)下,30s 时立即于 340nm 处分别读取 吸光值 A110min 后读取 A2A=A1-A2)测定-A1-A2对照(每个样本需做一个自身对照)。 【注】1. ΔA 的值在零附近徘徊,则可延长反应时间 T(如增至 40min 或更长),或加大样本 V1(如增至 60μL,则试剂三相应减少),则改变后的反应(孵育)时间 T 或加样体 V1 需代入计算公式重新计算。 2. 若起始值 A1 太大如超过 2(如颜色较深的植物叶片,一般色素较高,则起始值相对 会偏高),可以适当减少样本加样量(则试剂三相应增加),则改变后的加样体积需代 入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白在每分钟内氧化 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 P5CS 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=160.8×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织在每分钟内氧化 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 P5CS 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=160.8×ΔA÷W 3、按细菌/细胞数量计算: 单位定义:每 104个细胞在每分钟内氧化 1nmol NADPH 定义为一个酶活单位(U)。 P5CS 活性(nmoL/min /104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.322×A 4、液体中 P5CS 活力的计算: 单位定义:每毫升液体在每分钟内氧化 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 P5CS 活性(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1÷T=160.8×ΔA V---提取液体积,1mLV1---加入反应体系中样本体积,0.04mLV2---反应体系总体积:2×10-4 Ld---96 孔板光径,0.5cmT---反应时间,10minW---样本质量,gε---NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cmCpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。

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