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GABA转氨酶(GABA-T)试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-28

简要描述:

GABA转氨酶(GABA-T)试剂盒,微板法
γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T,EC 2.6.1.96)是 GABA 支路中的关键酶之一,催化 GABA 的降解和转化。

GABA转氨酶(GABA-T)试剂盒,微板法

GABA转氨酶(GABA-T)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)测定试剂盒说明书 (货号:WS3011W 微板法 48 样) 一、产品简介: γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-TEC 2.6.1.96)GABA 支路中的关键酶之一,催化 GABA 的降解和转化。 本试剂盒利用γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)催化丙酮酸和 GABA 反应生成生成琥 珀酸半醛和丙*酸,通过检测 GABA 的减少量进而得出 GABA-T 酶活力大小。 反应方程式:4-aminobutanoate + pyruvate = succinate semialdehyde + L-alanine 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部, 再加 3mL 试剂三溶解备用。 试剂二 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部, 再加 4.5mL 试剂三溶解备用。 试剂三 液体 8mL×1 4℃保存 试剂四 液体 11mL×1 4℃保存 试剂五 液体 10mL×1 4℃保存 试剂六 A:液体 8mL×3 B:液体 2mL×1 4℃保存 临用前取0.55mLB液进一瓶A 液中,混匀后作为试剂六使用。 混匀后的试剂六半个月内用完。 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样本情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、 样本制备: 取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆,12000rpm4℃离心 10min,取上清液待用。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取 2、 上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 645nm② 所有试剂解冻至室温,在 EP 管依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 40 40 试剂一 40 蒸馏水 40 试剂二 40 40 混匀,于 30℃孵育 30min 试剂四 80 80 立即混匀,室温 12000rpm,离心 5min,上清液待测本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 显色反应:于 EP 管中依次加入: 上清液 50 50 试剂四 30 30 试剂五 100 100 试剂六 200 200 混匀,沸水浴(95-100℃10min,冰浴至室温,呈现蓝绿色颜 色,若浑浊需 12000rpm 离心 5min,取澄清的 200μL 96 孔板 中,于 645nm 处读取各管的 A 值,A=A 对照-A 测定(每个样本 需做一个自身对照)【注】若ΔA 值在零附近,可增加样本质量 W(如增至 0.2g),或延长 30℃孵育时间 T(如增至 1h 或更长),或加大样本量 V1(如增至 80μL,则试剂四相应减少),则改变后的 W T V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线:y = 0.508x - 0.0003x 为标准品质量(mg/mL)y 为吸光值ΔA2、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每小时消耗 1mg GABA 定义为一个酶活力单位。 GABA-T (mg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷(V1×Cpr)÷T=19.7×(ΔA+0.0003)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每小时消耗 1mg GABA 定义为一个酶活力单位。 GABA-T (mg/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷(W×V1÷V)÷T =19.7×(ΔA+0.0003)÷W 4、按细菌/细胞数量计算: 单位定义:每 104个细胞每小时消耗 1mg GABA 定义为一个酶活单位。 GABA-T (mg/h/104 cell)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷(500×V1÷V)÷T =0.04×(ΔA+0.0003) 5、按照液体体积计算: 单位定义:每毫升液体每小时消耗 1mg GABA 定义为一个酶活力单位。 GABA-T(mg/h/mL)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷V1÷T=19.7×(ΔA+0.0003) V---提取液体积,1mLV1---加入反应体系中样本体积,0.04mLV2---反应体系总体积:0.2mLT---反应时间,30min=0.5hW---样本质量,gCpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 标准品母液(2mg/ml):标准品临用前加 1mL 蒸馏水溶解。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml。也可根据实 际样本来调整标准品浓度。 3 按照显色反应阶段的测定管加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。

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