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谷an酸脱羧酶(GAD)试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-28

简要描述:

谷an酸脱羧酶(GAD)试剂盒,微板法
谷*酸脱羧酶 (GAD,EC 4.1.1.15)是一种吡哆醛类裂解酶,能专一的催化 L-谷*酸 裂解成为 γ-氨基丁酸 (GABA)和 CO2。

谷an酸脱羧酶(GAD)试剂盒,微板法

谷an酸脱羧酶(GAD)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 谷*酸脱羧酶(GAD)测定试剂盒说明书 (货号:WS2011W 微板法 48 样) 一、产品简介: 谷*酸脱羧酶 (GADEC 4.1.1.15)是一种吡哆醛类裂解酶,能专一的催化 L-谷*酸 裂解成为 γ-氨基丁酸 (GABA)CO2GAD 广泛分布于动植物和微生物中:哺乳动物 体内 GAD 催化产生的 GABA 是一种重要的抑制性神经递质;在植物中 GAD 的活性高 低可指示种子发芽能力和出苗率等。 本试剂盒利用*酚和次氯酸钠比色法测定谷an酸脱羧酶(GAD)催化产生的 GABA最终生成蓝色物质,该物质在 645nm 处有明显光吸收,其颜色深浅与 GABA 含量呈正 比,进而得出 GAD 活力大小。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下,使粉体落到底部, 再加入 11mL 试剂二溶解备用, 试剂二 液体 22mL×1 4℃保存 试剂三 液体 30mL×1 4℃保存 试剂四 液体 1mL×1 4℃保存 试剂五 液体 8mL×1 4℃保存 试剂六 A:液体 4mL×2 B:液体 5mL×1 4℃保存 临用前取 2mL B 液进一瓶 A 中,混匀后作为试剂六使用。混匀 后的试剂半个月内用完。 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该标曲。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、谷an酸脱羧酶(GAD)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、 样本制备: ① 组织样本:取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆,12000rpm4℃离心 10min取上清液待用。 ② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细 胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s重复 30 次);12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 ③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。 2、 上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 645nm,在 EP 管依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 100 100 试剂一 200 试剂二 200 混匀,40℃孵育 30min 试剂三 200 200本试剂盒仅供科研使用 2 混匀,室温 12000rpm,离心 3min,上清液待测。 ② 显色反应:在 96 孔板中依次加入: 上清液 80 80 试剂三 50 50 试剂四 10 10 试剂五 80 80 试剂六 80 80 混匀,20℃放置 20min,于 645nm 处读取各管的 A 值, A=A 对照-A 测定(每个样本需做一个自身对照)【注】若ΔA 值在零附近,可增加样本质量 W(如增至 0.2g),或延长 40℃孵育时间 T(如增 1h 或更长),或加大样本量 V1(如增至 100μL,则试剂一和二相应减少),或增加② 步中上清液体积(由 80μL 增至 130μL 则试剂三相应减少),则改变后的 W T V1 V3 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线:y = 4.3244x - 0.0017x 为标准品摩尔质量(μmol)y 为吸光值ΔA2、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每分钟产生 1nmol GABA 定义为一个酶活力单位。 GAD(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0017)÷4.3244]×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T×103 =481.8×(ΔA+0.0017)÷Cpr 3、 按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每分钟产生 1nmol GABA 定义为一个酶活力单位。 GAD(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0017)÷4.3244]×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T×103 =481.8×(ΔA+0.0017)÷W 4、按细胞数量计算: 单位定义:每 104个细胞每分钟产生 1nmol GABA 定义为一个酶活单位。 GAD(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0017)÷4.3244]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T×103 =0.964×(A+0.0017) 5、按照液体体积计算: 单位定义:每毫升液体每分钟产生 1nmol GABA 定义为一个酶活力单位。 GAD(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0017)÷4.3244]×(V2÷V3)÷V1÷T×103=481.8×(ΔA+0.0017) V---提取液体积,1mLV1---加入反应体系中样本体积,0.1mLV2---反应体系总体积,0.5mLV3---第②步显色阶段上清液量,0.08mLT---反应时间,30minW---样本质量,g; 标准品 GABA 分子量---103.12500---细胞数量,万; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 标准品母液(1mg/mL):向 EP 管中加入 2mL 蒸馏水;把母液稀释成以下浓度梯度:0, 0.06, 0.12, 0.18, 0.24, 0.3 mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。 2 按照显色反应阶段的测定管加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。

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