乙酰fu酶A羧化酶(ACC)试剂盒(定磷法)微板法

乙酰fu酶A羧化酶(ACC)试剂盒(定磷法)微板法

乙酰fu酶A羧化酶(ACC)试剂盒(定磷法)微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 乙酰*酶 A 羧化酶(Acetyl CoA carboxylase，ACC)试剂盒说明书 （货号：WS3190W 微板法 48 样） 一、产品简介： 乙酰*酶A羧化酶（ACC，EC 6.4.1.2）广泛存在于生物界。在生物体内催化乙酰*酶A 羧化生成丙二酰*酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定 程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。 ACC 催化乙酰*酶 A、NaHCO3和 ATP 生成丙二酰辅酶 A、ADP 和无机磷，通过钼酸 铵定磷法测定无机磷的增加量来测定 ACC 酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 【注】：全程操作需无磷环境；试剂配置用新枪头和玻璃移液器等，也可用一次性塑料器皿，避免磷污染。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取 ② 细胞样本： 先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细胞加入 1mL 提取液；超声波破 碎细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；4ºC 约 12,000rpm 离心 10min，取上清作为待测样品。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，设置温度 37℃，调节波长至 700nm。 ② 试剂放在 37℃水浴 5min； ③ 在 EP 管中依次加入： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 提取液 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 20mL ×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 支 -20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再加 0.55mL 蒸馏水，混匀溶解备用。 试剂三 液体 4mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 A:粉体 mg×1 瓶 B:液体 2mL×1 瓶 4℃保存 临用前加1.8mL的B液，再加23.2mL 的蒸馏水，混匀溶解备用。 标准品 粉体 mg ×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 试剂名称（μL） 测定管 对照管 试剂一 190 200 样本 100 100本试剂盒仅供科研使用 2 ④ 显色反应，在 96 孔板中依次加入： 【注】若△A 差值小于 0.01，可增加样本取样质量 W（如增至 0.2g），或增加③步中样本加样体 积 V1(如由 100μL 增至 200μL，则试剂一相应减少)，或延长③步中 37℃条件下孵育时间 T （如由 30min 延至 60min），则改变后的 W 和 V1 和 T 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.6402x - 0.0034，x 是标准品摩尔质量（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白浓度计算： 定义：每小时每毫克组织蛋白分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0034)÷0.6404×V2] ÷(V1×Cpr)÷T =10.62×(△A+0.0034)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 定义：每小时每克组织分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0034)÷0.6404×V2]÷(W× V1÷V)÷T =10.62×(△A+0.0034)÷W 4、按细菌或细胞密度计算： 定义：每小时每 1 万个细菌或细胞分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h /104 cell)=[(△A+0.0034)÷0.6404×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.021×(△A+0.0034) V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.1mL； V2---酶促反应总体积，0.34mL； T---反应时间，1/2 小时； W---样本鲜重，g； 500---细菌或细胞总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（50μmol/mL）：标准品用 1mL 试剂一溶解。（母液需在两天内用）。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样 本来调整标准品浓度。 3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。 试剂二 10 37℃ 孵育 30min 试剂三 40 40 混匀，12000rpm，4℃离心 5min，上清液待测。 上清液 50 50 试剂四 200 200 混匀，室温静置 3min，700nm 下读取各管吸光值， △A=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。