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乙酰fu酶A羧化酶(ACC)试剂盒(定磷法)微板法

更新时间:2024-05-24

简要描述:

乙酰fu酶A羧化酶(ACC)试剂盒(定磷法)微板法
乙酰*酶A羧化酶(ACC,EC 6.4.1.2)广泛存在于生物界。在生物体内催化乙酰fu酶A羧化生成丙二酰*酶A,是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。

乙酰fu酶A羧化酶(ACC)试剂盒(定磷法)微板法

乙酰fu酶A羧化酶(ACC)试剂盒(定磷法)微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 乙酰*酶 A 羧化酶(Acetyl CoA carboxylaseACC)试剂盒说明书 (货号:WS3190W 微板法 48 一、产品简介: 乙酰*酶A羧化酶(ACCEC 6.4.1.2)广泛存在于生物界。在生物体内催化乙酰*酶A 羧化生成丙二酰*酶A,是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定 程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。 ACC 催化乙酰*酶 ANaHCO3ATP 生成丙二酰辅酶 AADP 和无机磷,通过钼酸 铵定磷法测定无机磷的增加量来测定 ACC 酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制: 【注】:全程操作需无磷环境;试剂配置用新枪头和玻璃移液器等,也可用一次性塑料器皿,避免磷污染。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、乙酰辅酶 A 羧化酶(ACC)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取 ② 细胞样本: 先收集细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细胞加入 1mL 提取液;超声波破 碎细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);4ºC 12,000rpm 离心 10min,取上清作为待测样品。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 2、上机检测① 酶标仪预热 30min 以上,设置温度 37℃,调节波长至 700nm② 试剂放在 37℃水浴 5min③ 在 EP 管中依次加入: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 提取液 60mL×1 4℃保存 试剂一 液体 20mL ×1 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 -20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部,再加 0.55mL 蒸馏水,混匀溶解备用。 试剂三 液体 4mL×1 4℃保存 试剂四 A:粉体 mg×1 B:液体 2mL×1 4℃保存 临用前加1.8mLB液,再加23.2mL 的蒸馏水,混匀溶解备用。 标准品 粉体 mg ×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 试剂名称(μL测定管 对照管 试剂一 190 200 样本 100 100本试剂盒仅供科研使用 2 ④ 显色反应,在 96 孔板中依次加入: 【注】若△A 差值小于 0.01,可增加样本取样质量 W(如增至 0.2g),或增加③步中样本加样体 V1(如由 100μL 增至 200μL,则试剂一相应减少),或延长③步中 37℃条件下孵育时间 T (如由 30min 延至 60min),则改变后的 W V1 T 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.6402x - 0.0034x 是标准品摩尔质量(μmol/mL, y 是△A2、按蛋白浓度计算: 定义:每小时每毫克组织蛋白分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(A+0.0034)÷0.6404×V2] ÷(V1×Cpr)÷T =10.62×(A+0.0034)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 定义:每小时每克组织分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(A+0.0034)÷0.6404×V2]÷(W× V1÷V)÷T =10.62×(A+0.0034)÷W 4、按细菌或细胞密度计算: 定义:每小时每 1 万个细菌或细胞分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h /104 cell)=[(A+0.0034)÷0.6404×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.021×(A+0.0034) V---加入提取液体积,1mLV1---加入样本体积,0.1mLV2---酶促反应总体积,0.34mLT---反应时间,1/2 小时; W---样本鲜重,g500---细菌或细胞总数,500 万; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(50μmol/mL):标准品用 1mL 试剂一溶解。(母液需在两天内用)。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样 本来调整标准品浓度。 3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。 试剂二 10 37℃ 孵育 30min 试剂三 40 40 混匀,12000rpm4℃离心 5min,上清液待测。 上清液 50 50 试剂四 200 200 混匀,室温静置 3min700nm 下读取各管吸光值, A=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。

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