腺苷脱氨酶（ADA)活性测定试剂盒,微板法

腺苷脱氨酶（ADA)活性测定试剂盒,微板法

腺苷脱氨酶（ADA)活性测定试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 腺苷脱氨酶（Adenosine deaminase, ADA)活性测定试剂盒说明书 (货号：WS8340W 微板法 96 样) 一、产品简介： 腺苷脱氨酶（ADA，EC 3.5.4.4）是一种琉基酶，是嘌呤核苷酸代谢的关键酶，与机体 细胞的免疫活性有重要关系。 腺苷脱氨酶（ADA）催化腺嘌呤核苷水解，产生次黄*呤核苷和氨，利用氨在强碱的 环境下与次氯酸盐和*酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝，溶液颜色稳定。其在 630nm 处 有特征吸收峰，通过检测氨增加的速率，即可计算该酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×2 瓶 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部，每瓶 再加 11mL 蒸馏水溶解备用。 试剂三 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 液体 12mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 液体 6mL×1 瓶 4℃保存 试剂六 A：液体 3.5mL×4 瓶 B：液体μL×1 支 4℃保存 临用前取 30μL 的 B 液进一瓶 A 液中， 混匀后作为试剂六使用。混匀后的试 剂六一周内用完。 标准管 液体 mL×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该标曲。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液枪、研钵、冰和蒸馏水。 四、腺苷脱氨酶（ADA）活性测定： 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织（水分足的样本可取 0.2-0.5g），加入 1mL 提取液；进行 冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取。 ② 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 630nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃），在 EP 管依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 40 40 试剂一 100 100 试剂二 100 试剂三 100 混匀，放入 37℃水浴锅或恒温培养箱中孵育 30min 试剂三 100 试剂二 100 混匀，室温 12000rpm 离心 5min，上清液待测。 ③ 显色反应：在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管本试剂盒仅供科研使用 2 上清液（上步反应） 30 30 蒸馏水 30 30 试剂四 60 60 试剂五 30 30 试剂六 60 60 充分混匀，37℃放置 20min 后，于 630nm 处读取吸光值 A， ΔA=A 测定管-A 对照管（每个样本做一个自身对照）。 【注】1. 试剂四和五和六需分开加，不能事先混匀。 2. 若ΔA 的值较小，可增加 37℃孵育时间（如增至 1 小时或更长），或在显色阶段增加上清液量 V1(如增至 60μL，则蒸馏水体积相应减少)；则改变后的 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 3. 若 A 测定大于 1.5，可减少 37℃孵育时间（如减至 10min 或更短），或在显色阶段减少上清液 量 V1(如减至 15μL，则蒸馏水体积相应增加)；则改变后的 T 和 V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为 y = 58.121x - 0.0118；x 为标准品摩尔质量（μmoL），y 为吸光值ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克蛋白质每小时催化腺苷生成 1μmoL 氨定义为一个酶活力单位。 ADA(μmoL/h/mg prot)=(ΔA+0.0118)÷58.121×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T =9.75×(ΔA+0.0118)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每小时催化腺苷生成 1μmoL 氨定义为一个酶活力单位。 ADA (μmoL/h/g 鲜重)=(ΔA+0.0118)÷58.121×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T =9.75×(ΔA+0.0118)÷W 4、按照液体体积计算： 单位定义：每毫升液体每小时催化腺苷生成 1μmoL 氨定义为一个酶活力单位。 ADA (μmoL/h/mL)=(ΔA+0.0118)÷58.121×(V2÷V3)÷V1÷T=9.75×(ΔA+0.0118)÷W V---提取液体积，1mL； V1----加入②歩反应体系中样本体积，0.04mL； V2---②歩反应体系总体积：0.34mL； V3---③歩显色步骤中上清液体积，0.03mL； T---反应时间，0.5h； W---样本质量； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 标准品母液（10μg/mL 的氨（分子量是 18）），把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度 的标准品：0, 2, 4, 6, 8, 10 μg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。 2 按照显色反应阶段的测定管加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。