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中性dan白酶(NPT)试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-24

简要描述:

中性dan白酶(NPT)试剂盒,微板法
蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中,中性*白酶(NPT)是在中性条件下将酪蛋白水解产生酪*酸

中性dan白酶(NPT)试剂盒,微板法

中性dan白酶(NPT)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 中性*白酶(Neutral protease, NPT)试剂盒说明书 (货号:WS4140W 微板法 48 样) 一、产品简介: 蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中,中性蛋*酶(NPT)是在中性条件下将酪 蛋白水解产生酪*酸;酪*酸与福林酚在碱性条件下反应生成蓝色化合物;该蓝色物质在 680nm 有特征 吸收峰,进而得中性*白酶活性, 由于底物酪蛋白自身含有多种氨基酸,所以在检测过程中必须设置带有底物酪蛋白的对照,以扣除有 干扰的背景值,排除假阳性。 二、测试盒组成和配制: 试剂名称 规格试剂名称 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×2 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×2 4℃保存 用前甩几下或 4离心使试剂落入试管底部, 每瓶加入 3mL 试剂二 90加热搅拌至分散, 再加 12mL 提取液搅拌至溶解,最后再加提 取液定容至 30mL,继续搅拌至全部溶解;配 置完的试剂 4保存,三天内用完。 试剂二 液体 10mL×1 4℃保存 用前摇匀 试剂三 液体 50mL×1 4℃保存 用前摇匀 试剂四 液体 40mL×1 4℃保存 用前摇匀 试剂五 液体 10mL×1 棕色瓶 4℃保存 现用现配,用前甩几下或 4离心使试剂落入 试管底部,再加 20mL 蒸馏水, 4保存, 一星期内用完。 标准品 粉体 mg×1 EP 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 【注】:试剂一若在磁力搅拌器(带温控)上溶解,可用锡箔纸或保鲜膜盖住烧杯,以免溶解过程中水分蒸发过快。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、蒸馏水 四、中性*白酶(NPT)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:测定管和对照管分别取约 0.1g 组织(水分充足的果实约 0.5g),加入 1mL 取液,进行冰浴匀浆;12000rpm4℃离心 15min;取上清液待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取 ② 细菌/真菌样本:测定管和对照管分别取约 500 万细胞加入 1mL 提取液,冰浴超声波破 碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);12000rpm4℃离心 15min取上清液待测。 【注】:若增加样本量,按细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~10001 比例进行提取 ③ 液体样本:澄清液体直接检测;若浑浊则 12000rpm4℃离心 15min;上清待测。 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 680nm,配制好的试剂一需预先 50℃水浴 10min② 在 2mL 离心管中依次加入下列试剂培养: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 500 500 试剂一 500 40℃振荡培养 10min,同时,余下的试剂一须单独 40℃振荡培养 10min本试剂盒仅供科研使用 2 上歩单独 40℃培养的试剂一 500 试剂三 500 500 混匀,室温静置 10min1500rpm(须准确),4℃离心 10min,上清液待用 ③ 显色反应:在 EP 管中依次加入: 上清液 250 250 试剂四 375 375 试剂五 250 250 40℃水浴 20min,取 200μL 澄清液(若浑浊,可 1500rpm 离心 10min96 孔板中,于 680nm 读取吸光值 A,△A=A 测定管-A 对照管。 【注】1.若△A 在零附近徘徊,可以加大样本量(如增加到 0.2g),或延长 40℃培养时间(如增加至 30min),或在显色反应阶段加大上清液体积(如,增加至 350μL,则试剂五相应减少),则改 变后的样本质量 W,反应时间 T 和显色步骤中的上清液体积 V1 需代入公式重新计算。 2.若测定管的 A 值大于 1.5,可减少样本取样量(如减少到 0.05g),或把上清液用蒸馏水进行稀 释,稀释倍数 D 代入公式参与计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.0626x + 0.0011x 是标准品质量(μg),y ΔA2、按照蛋白浓度计算: 活性单位定义:40℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生 1μg 酪*酸为 1 个酶活单位。 NPT 活性(μg/min/mg prot)=(ΔA-0.0011)÷0.0626×(V3÷V2)÷(Cpr×V1÷V)÷T×D =19.2×(ΔA-0.0011) ÷Cpr×D 3、按照样本质量计算: 活性单位定义:40℃每克样品每分钟催化水解产生 1μg 酪*酸为 1 个酶活单位。 NPT 活性(μg/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0011) ÷0.0626×(V3÷V2)÷(W×V1÷V)÷T×D =19.2×(ΔA-0.0011) ÷W×D 4、按照细胞数量计算: 活性单位定义:40℃每 104个细胞每分钟催化水解产生 1μg 酪*酸为 1 个酶活单位。 NPT 活性(μg/min/104 cell)=(ΔA-0.0011) ÷0.0626×(V3÷V2)÷(细胞数量×V1÷V)÷T×D =19.2×(ΔA-0.0011)÷细胞数量×D 5、按液体体积计算: 活性单位定义:40℃每毫升液体样本每分钟催化水解产生 1μg 酪*酸为 1 个酶活单位。 NPT 活性(μg/min/mL)=(ΔA-0.0011) ÷0.0626×(V3÷V2)÷V4÷T×D =19.2×(ΔA-0.0011) ×D V---提取液体积,1mLV1---样本体积,0.5mLV2---显色步骤上清液体积,0.25mLV3---培养步骤总反应体积,1.5mLV4---液体样本,0.5mL; 酪*酸分子量---181.19T---反应时间,10minW---样本质量,gD---稀释倍数,未稀释即为 1Cpr---粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),建议使用本公司的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒检测。 附:标准曲线制作过程: 1 标准品母液(100μg/mL):标准品溶于 100mL 0.1mol/L 盐酸溶液中(两天内用完且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度标准品:0, 4, 8, 12, 16, 20. μg/mL。也可根据实际来调整标准品浓度。 3 依据测定管的显色反应阶段加样表依次加样,根据结果即可制作标准曲线。

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