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亚硝酸还原酶(NiR)试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-27

简要描述:

亚硝酸还原酶(NiR)试剂盒,微板法
亚硝酸还原酶(NiR,EC1.7.2.1)是一类能催化亚硝酸盐还原的氧化还原酶,广泛存在于微生物及植物体内,是自然界氮循环过程中的关键酶,可以将亚硝酸盐降解为 NO 或 NH3,从而减少环境中亚硝态氮的积累,降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。

亚硝酸还原酶(NiR)试剂盒,微板法

亚硝酸还原酶(NiR)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 亚硝酸还原酶(Nitrite reductaseNiR)试剂盒说明书 (货号:WS8040W 微板法 96 样) 一、产品简介: 亚硝酸还原酶(NiREC1.7.2.1)是一类能催化亚硝酸盐还原的氧化还原酶,广泛存在于微生物及植 物体内,是自然界氮循环过程中的关键酶,可以将亚硝酸盐降解为 NO NH3,从而减少环境中亚硝 态氮的积累,降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。 亚硝酸还原酶可将 NO2 -还原为 NO,使样品中参与对氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成(粉)红色偶氮 化合物的 NO2 -减少,根据颜色深浅即 540nm 处吸光值的变化可反应亚硝酸还原酶的活性。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 4℃保存 用前摇匀,且用蒸馏水稀释一倍做为提取液使用。 试剂一 粉体 mg×4 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部,每 支加 3mL 提取液溶解。 试剂二 粉剂 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部,再 6mL 提取液溶解。 试剂三 试剂三 Amg×3 试剂三 Bmg×3 4℃保存 临用前一支试剂 A B 分别用 1mL 蒸馏水wan全溶解,再把 1mL 试剂 B 倒入 1mL 试剂 A 中混成试剂三 mix(一周内用完)试剂四 粉体 g×1 4℃保存 临用前加 12mL 蒸馏水溶解。 试剂五 液体 12mL×1 4℃保存 临用前,可依据待检测样本数量, 把试剂五和六等比例混合成无色反应 mix(注意观察,若变粉色, 则不能使用)。 两天之内用完。 试剂六 液体 12mL×1 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、可调式移液器、天平、研钵、水浴锅、低温离心机。 四、亚硝酸还原酶(NiR)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min取上清,置冰上待测。 ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液; 超声波破碎细菌或细胞(冰浴,300W,超声 3s,间隔 7s,总时间 3min);10000g 4℃10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,按照细菌/细胞数量(104):提取液体积(mL)500~10001 的比例进行提取。 2、上机检测① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 540nm② 在 EP 管中加入下列试剂: 试剂名称(μL测定管 对照管本试剂盒仅供科研使用 2 试剂一 50 50 试剂二 50 提取液 330 430 样本 20 20 试剂三 mix 50 混匀(此时反应液应为深蓝色),于 37℃下反应 30min 后,立即于漩涡 震荡仪上剧烈震荡直到颜色wan全消失。 试剂四 50 50 混匀,12000rpm,室温离心 5min,上清液待测。 ③ 显色反应,在 96 孔板中依次加入: 上清液 20 20 蒸馏水 100 100 反应 mix 100 100 混匀,室温反应 10min立即540nm 处分别读取吸光值 AA =A 对照- A 测定(每个测定管需设一个对照管)。 【注】:1. A 值在零附近徘徊,可增加样本体积 V1(如增至 50μL 或更多,则提取液相应减少),或延 长反应时间 T(如增至 1h),则改变后的 V1 T 代入计算公式重新计算。 2. A 值需小于 1,若大于则需减少样本体积 V1(如减至 10μL 或更少,则提取液相应增加),或 缩短反应时间 T(如减至 10min),则改变后的 V1 T 代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 1.8966x + 0.0119x 为标准品摩尔浓度(μmol/mL),y A2、按照蛋白含量计算: 酶活定义:每毫克组织蛋白每小时还原 1μmol NO2 ˉ的量为一个酶活力单位。 NiR(μmol/h/mg prot)=[(A-0.0119)÷1.8966×V2]÷(V1×Cpr)÷T=29×(A-0.0119)÷Cpr 3、按照样本质量计算: 酶活定义:每三克组织每小时还原 1μmol NO2 ˉ的量为一个酶活力单位。 NiR(μmol/h/g 鲜重)=[(A-0.0119)÷1.8966×V2]÷(W×V1÷V)÷T=29×(A-0.0119)÷W 4、按照细菌/细胞数量计算: 酶活定义:每 104个细胞每小时还原 1μmol NO2 ˉ的量为一个酶活力单位。 NiRμmol/h/104 cell)=[(A-0.0119)÷1.8966×V2]÷(细胞数量×V1÷V)÷T =29×(A-0.0119)÷细胞数量 V---加入提取液体积,1mLV1---体系中加入样本体积,0.02mLV2--反应阶段总体积,0.55mLT---反应时间,30min=1/2h; 细胞数量---500 万; W---样本质量,gCpr---样本蛋白含量,建议使用本公司 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 标准品母液(100μmol/mL):标准品用 1mL 蒸馏水溶解。(需两天内用且-20℃保存)。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4,0.5. μmol/mL本试剂盒仅供科研使用 3 按照显色反应阶段的加样顺序操作:根据结果即可制作标准曲线。 3


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