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脲酶(UE)试剂盒

更新时间:2024-05-24

简要描述:

脲酶(UE)试剂盒
脲酶(UE;EC 3.5.1.5)是一种含镍的寡聚酶,特异性地催化尿素水解释放出氨和二氧化碳。脲酶活性与有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关,反应了氮素状况。

脲酶(UE)试剂盒

脲酶(UE)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 脲酶(UreaseUE)测定试剂盒说明书 (货号:WS2140F 分光法 24 ) 一、产品简介: 脲酶(UEEC 3.5.1.5)是一种含镍的寡聚酶,特异性地催化尿素水解释放出氨和二氧化碳。脲酶活性 与有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关,反应了氮素状况。 本试剂盒利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的 NH3-N,其在强碱性介质中与次氯酸盐和*酚反 应,生成水溶性染料靛酚蓝,其深浅与溶液中的 NH3-N 含量呈正比,该物质在 578nm 有最大光吸收,其 深浅与溶液中的 NH3-N 含量呈正比,进而得出脲酶活力大小。 二、测试盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60 mL×1 4℃保存 试剂一 液体 20mL×1 4℃保存 试剂二 粉剂 g×1 4℃保存 用前甩几下或 4离心使试剂落入试管底部,再加 3mL 蒸馏水,充分溶解,用不完的试剂 4保存。 试剂三 液体 13mL×1 4℃保存 避光保存。 试剂四 液体 7mL×1 4℃保存 试剂五 A:液体 7mL×2 B:液体μL×1 4℃保存 临用前取 60μL B 液进一瓶 A 液中,混匀后作为 试剂五使用。混匀后的试剂五一周内用完。 标准品 液体 1 mL×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵。 四、脲酶(UE)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、 样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,冰浴 匀浆,12000rpm4℃离心 10min,取上清液待用。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取 ② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或 细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 ③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。 2、 上机检测: ① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 578nm,蒸馏水调零。 ② 在 EP 管依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本上清液 20 20 试剂一 190 190 试剂二 90 蒸馏水 90 混匀,放入 40℃水浴锅或恒温培养箱中孵育 1h ③ 显色反应:在 EP 管中依次加入:本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称(μL测定管 对照管 ②步反应混合液 60 60 蒸馏水 180 180 试剂三 240 240 试剂四 120 120 试剂五 240 240 充分混匀,37℃放置 20min 后,全部液体转移至 1mL 玻璃比 色皿(光径 1cm)中,于 578nm 处读取吸光值 AΔA=A 测定管-A 对照管(每个样本做一个自身对照)。 【注】1. 试剂三和四和五需分开加,不能事先混合。 2. ΔA 值较小,可增加取样质量 W(如 0.2g 或更多)或在步中增加样本加样体积 V1(如增至 50μL,则试剂一相应减少),或在步显色反应阶段增加上清液量 V2(如增至 100μL,则蒸馏水 体积相应减少);则改变后的 W V1 V2 需代入计算公式重新计算。 3. A 测定值大于 1.8,可在步阶段减少上清液量 V2(如减至 30μL,则蒸馏水体积相应增加)或用蒸馏水稀释步检测用到的上清液,则改变后的 V2 和稀释倍数 D 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程为 y=1.0438x - 0.0015x 为标准品质量(μg),y 为吸光值ΔA2、按样本蛋白浓度计算: 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟产生 1μg NH3-N 定义为一个酶活力单位。 脲酶(UE)(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0015)÷1.0438]×(V3÷V2)÷(V1×Cpr)÷T×D =4×(ΔA+0.0015)÷Cpr×D 3、按样本鲜重计算: 酶活定义:每克组织每分钟产生 1μg NH3-N 定义为一个酶活力单位。 脲酶(UE)(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0015)÷1.0438]×(V3÷V2)÷(W×V1÷V)÷T×D =4×(ΔA+0.0015)÷W×D 4、按细胞数量计算: 酶活定义:每 104个细胞每分钟产生 1μg NH3-N 定义为一个酶活力单位。 脲酶(UE) (μg/min/104 cell)=[(ΔA+0.0015)÷1.0438]×(V3÷V2)÷(500×V1÷V)÷T×D =0.008×(ΔA+0.0015)×D 5、按液体体积计算: 酶活定义:每毫升液体每分钟产生 1μg NH3-N 定义为一个酶活力单位。 脲酶(UE)(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0015)÷1.0438]×(V3÷V2)÷V1÷T×D=4×(ΔA+0.0015)×D V---提取液体积,1mLV1---②步反应体系中样本加样体积,0.02mLV2---③步显色阶段上清液体积,0.06mLV3---②步反应总体积,0.3mLT---反应时间,60minW---样本质量,g500---细胞数量; D---稀释倍数,未稀释即为 1Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1. 把标准品母液(1mg/mL),用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品:0,2,4,6,8,10. μg/mL。也可根据 实际样本来调整标准品浓度。 2. 在③步显色反应阶段,按照测定管加样表操作,依据结果即可制作标准曲线。

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