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可溶性酸性转化酶(S-AI)试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-22

简要描述:

可溶性酸性转化酶(S-AI)试剂盒,微板法
蔗糖酶即蔗糖转化酶(Invertase,E.C.3.2.1.26)在蔗糖代谢中催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。

可溶性酸性转化酶(S-AI)试剂盒,微板法

可溶性酸性转化酶(S-AI)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 可溶性酸性转化酶(Soluble acid invertase, S-AI)试剂盒说明书 (货号:WS7150W 微板法 48 样) 一、产品简介: 蔗糖酶即蔗糖转化酶(InvertaseE.C.3.2.1.26)在蔗糖代谢中催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖,是高等 植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 PH 值,蔗糖转化酶分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两 种类型,许多报道均将中性转化酶同碱性转化酶看作一种转化酶。 AI 的最适 pH 3.05.0AI 分为可溶性 AI(S-AI)和细胞壁不溶性 AIB-AI)两种类型。前者分布 在液泡中或细胞自由空间,后者存在于细胞间隙并结合在细胞壁上。 S-AI 催化蔗糖降解产生还原糖,进一步与 3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,经光谱 扫描在 540nm 有特征光吸收,在一定范围内 540nm 光吸收增加速率与 S-AI 活性成正比。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 液体 30mL×1 4℃保存 试剂二 粉剂×1 4℃保存 用前加入 7.5mL 试剂一充分溶解 备用;用不完的试剂 4保存; 试剂三 液体 10mL×1 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、可溶性酸性转化酶(S-AI)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: 称样本 0.1g(水分充足的样本可取 0.5g)于研钵中,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆后 转入离心管中。12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注意】 若样本含糖量高,可引起 A 对照值较大如超过 1.6,即检测背景值过高会影响检测,可在样本 制备过程中增加除糖步骤:取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 经预冷的 95%乙醇 冰浴匀浆,4放置 10min12000rpm4离心 5min;弃上清,留沉淀,向沉淀中加入经预冷的 80% 乙醇混匀,4放置 5min12000rpm4离心 5min;弃上清,留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 经预冷 提取液涡旋混匀,4放置 10min12000rpm4离心 10min;留上清,弃沉淀。上清液置冰上待测。 2、上机检测: 1 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 540nm2 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 40 40 试剂一 100 200 试剂二 100 混匀,37℃准确水浴 20min 后,95℃水浴 10min(用封口膜缠紧, 以防止水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变)。 试剂三 100 100 混匀,95℃水浴 10min(用封口膜缠紧,以防止水分散失),流水 冷却后充分混匀,吸取 200μL 转移至 96 孔板中,540nm 处读取本试剂盒仅供科研使用 2 吸光值 AΔA=A 测定-A 对照(每个测定管需设一个对照管)。 【注】:1.若吸光值大于 1.5,可以用蒸馏水稀释样本后测定,计算公式中乘以相应稀释倍数 D2.ΔA 值在零附近徘徊,可增加样本加样体积 V1(如增至 80μL,则试剂一相应减少),或 延长 37℃水浴时间(如增至 40min 或更长),则相应的 V1 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程为 y = 0.007x - 0.0234x 为标准品质量(μg),y ΔA2、按蛋白浓度计算: 单位定义:37℃每毫克蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 可溶性酸性转化酶(S-AI) (μg/min/mg prot)=[(ΔA +0.0234)÷0.007]÷(V1×Cpr)÷T×D =178.6×(ΔA +0.0234) ÷Cpr×D 3、按鲜重计算: 单位定义:37℃每克组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 可溶性酸性转化酶(S-AI) (μg/min/g 鲜重)=[(ΔA +0.0234)÷0.007]÷(W×V1÷V) ÷T×D =178.6×(ΔA +0.0234)÷W×D V---加入提取液体积,1mLV1---加入反应体系中样本体积,0.04mLT---反应时间,20minW---样本鲜重,gD---稀释倍数,未稀释即为 1Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒; 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(5mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水(母液需在两天 内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 1, 2, 3, 4, 5. mg/mL。也可根据实际样本来 调整标准品浓度。 3 按照:40μL 标准品+200μL 试剂一+100μL 试剂三,依次加样操作,95℃水浴 10min冷却后,取 200μL 96 孔板中,540nm 下测定,根据结果即可制作标准曲线。

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