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ADPG焦磷酸化酶,微板法

更新时间:2024-05-27

简要描述:

ADPG焦磷酸化酶,微板法
ADPG 焦磷酸化酶(AGP,EC 2.7.7.27)是植物淀粉合成过程中起关键性调节作用的酶,催化 l-磷酸葡萄糖(G-1-P)与三磷酸腺苷(ATP)反应形成淀粉合成的直接前体腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG),在植物中,主要存在于贮藏器官和叶片中。

ADPG焦磷酸化酶,微板法

ADPG焦磷酸化酶,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylaseAGP)活性测定试剂盒说明书 (货号:WS6350W 微板法 96 样) 一、产品简介: ADPG 焦磷酸化酶(AGPEC 2.7.7.27)是植物淀粉合成过程中起关键性调节作用的酶, 催化 l-磷酸葡萄糖(G-1-P)与三磷酸腺苷(ATP)反应形成淀粉合成的直接前体腺苷二磷酸葡 萄糖(ADPG),在植物中,主要存在于贮藏器官和叶片中。 AGP 催化的逆向反应生成 G1P,在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖 脱氢酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH340nm 下测定 NADPH 增加速率,即可 计算 AGP 活性。 二、测试盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体120mL×14℃保存 试剂一 粉体mg×1-20℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部,再 1.1mL蒸馏水溶解,仍-20℃保存。 试剂二 粉体mg×14℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部,再 1.1mL蒸馏水溶解。仍4℃保存。 试剂三 液体13mL×14℃保存 试剂四 粉体mg×1-20℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部,再 2.1mL 蒸馏水溶解,仍-20℃保存。 【注】:粉剂量在 mg 级别,使用前用手甩几次或者进行离心,打开直接加入要求的试剂即可。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: 组织样本: 称取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.2g),加 1mL 提取液,进行冰浴匀浆, 12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:也可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取。 【注意】 若样本颜色较深(如较深颜色的植物叶片),可引起起始值 A1 值较大如超过 1.5,可在样本 制备过程中增加除色素步骤:取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 80%乙醇冰浴匀浆, 12000rpm4离心 10min,弃掉色素较深的上清液;以上除色素步骤重复 2 次。最后向离心得到的 沉淀中加入 1mL 提取液,混匀或再次冰浴匀浆,12000rpm4离心 10min,取上清置冰上待测。 液体样品:澄清的液体样本直接检测;若浑浊则离心后取上清液检测。 2、上机检测① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,设定温度为 30℃。 ② 所有试剂解冻至室温(25℃),在 96 孔板中依次加入: 试剂名称(μL测定管 样本 40 试剂一 10本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二 10 试剂三 120 轻轻混匀,30℃孵育 10min试剂四 20 轻轻混匀,反应开始,30℃条件下,30S 340nm 处读取 吸光值 A130min 后读取 A2,△A=A2-A1【注】1. ΔA 在零附近徘徊,可延长反应时间 T 60min 后或更长读取 A2;或加大样本上样量 V1(如增至 80μL,则试剂三相应减少,保持总体积不变);或增加样本取样质量 W则改变后的 T V1 以及 W 需代入计算公式重新计算; 2. 若上升趋势不稳定,可以每隔 10S 读取一次吸光值,选取一段线性上升的时间段来参与 计算,相对应的 A1 A2 值也代入计算公式重新计算。 3. 若△A 的值大于 0.4,需缩减反应时间 T(如减至 10min 或更短),或减少样本上样量 V1 (如减至 20μL,则试剂三相应增加,保持总体积不变);则改变后反应时间 T V1 代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、按样本蛋白蛋白浓度计算 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活性单位。 AGP(nmol/min /mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=53.6×ΔA÷Cpr 2、按照样本鲜重计算 酶活定义:每克组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 AGP(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=53.6×ΔA÷W 3、按照液体体积计算: 酶活定义:每毫升液体每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 AGP(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T =53.6×ΔA ε---NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cmV---加入提取液体积,1mLV1---加入样本体积,0.04mLV2---反应体系总体积,2×10-4 Ld---比色皿光径,0.5cmT---反应时间,30minW---样本质量,g Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。


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