蔗糖磷酸化酶(SPase)试剂盒,微板法

蔗糖磷酸化酶(SPase)试剂盒,微板法

蔗糖磷酸化酶(SPase)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）试剂盒说明书 （货号：WS4150W 微板法 96 样） 一、产品简介： 蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，是一种葡萄糖基转移酶，催化葡萄糖基转移到 果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等，合成相应的葡萄糖基低聚糖。在食品，化妆品，医药行业具有广泛的应 用。 本试剂盒提供一种简单，灵敏，快速的测定方法：蔗糖磷酸化酶以磷酸为受体，催化蔗糖产生 1-磷酸 葡萄糖，在相应酶混合物的作用下使 NADP+还原成 NADPH，进而与特异的显色剂反应，产生在 450nm 有 最大吸收峰的黄色物质，可算出蔗糖磷酸化酶（SP）的活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 110mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前加 1.1mL 蒸馏水溶解，仍-20℃保存 试剂三 液体 14μL×1 支 -20℃保存 临用前加 1.1mL 蒸馏水溶解，仍-20℃保存 试剂四 液体 1.1mL×1 支 4℃保存 试剂五 粉剂 mg×1 瓶 4℃保存 临用前加 5.3mL 蒸馏水溶解，仍 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调式移液器、天平、低温离心机、研钵、冰、蒸馏水。 四、蔗糖磷酸化酶（SP）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取 上清液置于冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌/真菌样本： 取约 500 万个细胞，加入 1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3S， 间隔 5S，总时间 3min）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清液置于冰上待测 【注】：若增加样本量，按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取 2、 上机检测： ① 酶标仪预热 30min，调节波长至 450nm。 ② 所有试剂在检测前解冻至常温（25℃）状态。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 10 试剂一 110 试剂二 10 试剂三 10 试剂四 10 试剂五 50 室温（25℃）下反应，混匀后，立即于 450nm 处读取吸光值本试剂盒仅供科研使用 2 A1，40S 后读取 A2。△A=A2-A1。 【注】：1 若△A 值在零附近，可以适当延长反应时间，每隔 20s 读取一次吸光值，选择吸 光值呈线性增长的一段反应时间 T，重新确定的 T 需代入计算公式重新计算。 2 若样本做特殊处理或本身含有高浓度的还原型物质（如维生素 * 等，），需加设一 个样本自身对照（对照加样顺序：10μL 样本+160μL 试剂一+10μL 试剂二+10μL 试剂三+10μL 试剂四） 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.0862x - 0.0108，x 是 NADPH 摩尔质量：nmol,y 是ΔA。 2、按照蛋白浓度计算 单位定义：在 25℃条件下，每毫克蛋白质每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 SP 活性（nmol/min /mg prot）=[(ΔA+0.0108)÷0.0862] ÷(Cpr×V1)÷T=1740×(ΔA+0.0108)÷Cpr 3、按照样本质量计算 单位定义：在 25℃条件下，每克样本每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 SP 活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA+0.0108)÷0.0862] ÷(W×V1÷V)÷T=1740×(ΔA+0.0108)÷W 4、 按照细胞数量计算 单位定义：在 25℃条件下，每 104个细胞每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 SP 活性（nmol/min/104 cell）=[(ΔA+0.0108)÷0.0862]÷(500×V1÷V)÷T=3.48×(ΔA+0.0108) V----加入提取液体积，1 mL； V1----反应体系中样本体积，0.01mL； W----样本质量，g； T----反应时间，40s=2/3 min； Cpr----蛋白浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 注意事项： 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1nmol/μL）：向标准品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸馏水（母液需在两 天内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 依据加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。