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蔗糖磷酸化酶(SPase)试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-22

简要描述:

蔗糖磷酸化酶(SPase)试剂盒,微板法
蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中,是一种葡萄糖基转移酶,催化葡萄糖基转移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等,合成相应的葡萄糖基低聚糖。

蔗糖磷酸化酶(SPase)试剂盒,微板法

蔗糖磷酸化酶(SPase)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 蔗糖磷酸化酶(Sucrose Phosphorylase, SP)试剂盒说明书 (货号:WS4150W 微板法 96 样) 一、产品简介: 蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中,是一种葡萄糖基转移酶,催化葡萄糖基转移到 果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等,合成相应的葡萄糖基低聚糖。在食品,化妆品,医药行业具有广泛的应 用。 本试剂盒提供一种简单,灵敏,快速的测定方法:蔗糖磷酸化酶以磷酸为受体,催化蔗糖产生 1-磷酸 葡萄糖,在相应酶混合物的作用下使 NADP+还原成 NADPH,进而与特异的显色剂反应,产生在 450nm 最大吸收峰的黄色物质,可算出蔗糖磷酸化酶(SP)的活性大小。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 110mL×1 4℃保存 试剂一 液体 15mL×1 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×1 -20℃保存 临用前加 1.1mL 蒸馏水溶解,仍-20保存 试剂三 液体 14μL×1 -20℃保存 临用前加 1.1mL 蒸馏水溶解,仍-20保存 试剂四 液体 1.1mL×1 4℃保存 试剂五 粉剂 mg×1 4℃保存 临用前加 5.3mL 蒸馏水溶解,仍 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 -20℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、可调式移液器、天平、低温离心机、研钵、冰、蒸馏水。 四、蔗糖磷酸化酶(SP)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,12000rpm4℃离心 10min,取 上清液置于冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取 ② 细菌/真菌样本: 取约 500 万个细胞,加入 1mL 提取液,冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3S间隔 5S,总时间 3min);12000rpm4℃离心 10min,取上清液置于冰上待测 【注】:若增加样本量,按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~10001 的比例进行提取 2、 上机检测: ① 酶标仪预热 30min,调节波长至 450nm② 所有试剂在检测前解冻至常温(25℃)状态。 ③ 在 96 孔板中依次加入: 试剂名称(μL测定管 样本 10 试剂一 110 试剂二 10 试剂三 10 试剂四 10 试剂五 50 室温(25℃)下反应,混匀后,立即于 450nm 处读取吸光值本试剂盒仅供科研使用 2 A140S 后读取 A2。△A=A2-A1注】1 A 值在零附近,可以适当延长反应时间,每隔 20s 读取一次吸光值,选择吸 光值呈线性增长的一段反应时间 T,重新确定的 T 需代入计算公式重新计算。 2 若样本做特殊处理或本身含有高浓度的还原型物质(如维生素 * 等,),需加设一 个样本自身对照(对照加样顺序:10μL 样本+160μL 试剂一+10μL 试剂二+10μL 试剂三+10μL 试剂四) 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.0862x - 0.0108x NADPH 摩尔质量:nmol,y ΔA2、按照蛋白浓度计算 单位定义:在 25℃条件下,每毫克蛋白质每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 SP 活性(nmol/min /mg prot=[(ΔA+0.0108)÷0.0862] ÷(Cpr×V1)÷T=1740×(ΔA+0.0108)÷Cpr 3、按照样本质量计算 单位定义:在 25℃条件下,每克样本每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 SP 活性(nmol/min /g 鲜重)=[(ΔA+0.0108)÷0.0862] ÷(W×V1÷V)÷T=1740×(ΔA+0.0108)÷W 4、 按照细胞数量计算 单位定义:在 25℃条件下,每 104个细胞每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 SP 活性(nmol/min/104 cell=[(ΔA+0.0108)÷0.0862]÷(500×V1÷V)÷T=3.48×(ΔA+0.0108) V----加入提取液体积,1 mLV1----反应体系中样本体积,0.01mLW----样本质量,gT----反应时间,40s=2/3 minCpr----蛋白浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 注意事项: 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1nmol/μL):向标准品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸馏水(母液需在两 天内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 依据加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。

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