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α-半乳糖苷酶(α-GAL)试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-21

简要描述:

α-半乳糖苷酶(α-GAL)试剂盒,微板法
α-半乳糖苷酶(α-GAL,EC 3.2.1.22)可特异性地水解多糖、糖脂、糖蛋白中糖链末端的α-半乳糖苷键。

α-半乳糖苷酶(α-GAL)试剂盒,微板法

α-半乳糖苷酶(α-GAL)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase, α-GAL)试剂盒说明书 (货号:WS3250W 微板法 48 样) 一、产品简介: α-半乳糖苷酶(α-GALEC 3.2.1.22)可特异性地水解多糖、糖脂、糖蛋白中糖链末端 α-半乳糖苷键。在人、动物、植物、微生物体内均存在。在食品饲料和医药等领域中 有着广泛的应用前景。 本试剂盒提供一种简单,灵敏,快速的测定方法,α-GAL 分解对-硝基苯-α-D-吡喃半 乳糖苷生成黄色的对-硝基*酚(PNP),后者在 405nm 有最大吸收峰,通过测定吸光值 升高速率来计算α-GAL 活性。 二、测试盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 4℃保存 临用前加 1.5ml 水。 试剂二 液体 5mL×1 4℃保存 试剂三 20mL×1 4℃保存 标准品 粉剂×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、α-半乳糖苷酶(α-GAL)活性检测: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,冰浴 匀浆,然后 12000rpm4℃,离心 10min,取上清作为粗体液,置于冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取 ② 细菌或细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细 胞,加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s间隔 10s,重复 30 次);15000 rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104):提取液体积(mL)500~1000:1 比例进行提取。 ③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,温度设定 37℃,波长设定为 405nm② 在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 10 10 试剂一 25 蒸馏水 25 试剂二 35 35 迅速混匀,37℃保温 30min 试剂三 180 180本试剂盒仅供科研使用 2 混匀, 取 200μL 转移到 96 孔板中,405nm 处测定吸光 AΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。 【注】:若ΔA 过小,可以延长保温时间(如:40min 或更长),或增加样本上样量 V1 (如增至 30μL,则试剂三相应减少),则改变后的 T V1 需重新代入计算公式计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.0438x - 0.0008x 是标准品 PNP 的质量(nmol),y ΔA2、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol -硝基*酚(PNP)定义为一个酶活单位。 α-GAL 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0008)÷0.0438]÷(V1×Cpr)÷T=76.1×(ΔA+0.0008)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每分钟产生 1nmol -硝基*酚(PNP)定义为一个酶活单位。 α-GAL 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0008)÷0.0438]÷(W×V1÷V)÷T=76.1×(ΔA+0.0008)÷W 4、按细菌或细胞密度计算: 单位定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1nmol -硝基*酚定义为一个酶活性单位。 α-GAL 活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA+0.0008)÷0.0438]÷(500×V1÷V)÷T=0.152×(ΔA+0.0008) 5、按液体体积: 单位定义:每毫升液体每分钟产生 1nmol -硝基*酚(PNP)定义为一个酶活单位。 α-GAL 活性(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0008) ÷0.0438]÷V1÷T=76.1×(ΔA+0.0008) V---加入提取液体积,1mLV1---加入反应体系中样本体积,0.01mLW---样本质量,gT---反应时间,30minPNP 对分子质量---139.11500---细胞或细菌数量,万; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1ml 蒸馏水。 2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3mg/mL。也 可根据实际样本来调整标准品浓度。 3 EP 管加入:10μL 标准品+25μL 蒸馏水+35μL 试剂二+180μL 试剂三,混匀,取 200μL 96 孔板中,于 405nm 下读取吸光值。 4 根据结果制作标准曲线。

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