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内切-β1,4-葡聚糖酶/纤维素酶试剂盒微板法

更新时间:2024-05-21

简要描述:

内切-β1,4-葡聚糖酶/纤维素酶试剂盒微板法
内切-β-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)存在于细菌、真菌和动物体内,是纤维素酶系的组份之一,这类酶随机水解β-1,4-糖苷键,将无定形长链纤维素分子截短

内切-β1,4-葡聚糖酶/纤维素酶试剂盒微板法

内切-β1,4-葡聚糖酶/纤维素酶试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶试剂盒说明书 (货号:WS3350W 微板法 96 样) 一、产品简介: 内切-β-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)存在于细菌、真菌和动物体内,是纤维素酶系的组份 之一,这类酶随机水解β-1,4-糖苷键,将无定形长链纤维素分子截短,将其分解成葡萄糖、 纤维二糖、纤维三糖等各种类型的还原糖,在碱性条件下,产生的还原糖能与3,5-二硝基 水杨酸反应生成棕红色物质,该物质在540nm下有最大吸收峰,即可得出内切-β-1,4-葡聚 糖酶的酶活性大小。 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 110mL×1 4℃保存 试剂一 液体 32mL×1 4℃保存 试剂二 粉剂×1 4℃保存 临用前加 16mL 试剂一,80℃浴,搅拌至溶解,仍 4℃保存。 试剂三 液体 30mL×1 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织:称取约 0.2g 组织(水分充足的样本可取 1g),加入 1mL 经预冷的 95%乙醇冰浴 匀浆,4℃放置 10min12000rpm4℃离心 5min;弃上清,留沉淀,向沉淀中加入经 预冷的 80%乙醇混匀,4℃放置 10min12000rpm4℃离心 5min;弃上清,留沉淀。 再向沉淀中加入 1mL 经预冷提取液,涡旋混匀,4℃放置 10min12000rpm4℃离心 10min;留上清,弃沉淀。上清液置冰上待测。 ② 细菌/培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细 胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间 10s,重复 30 次);12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 5001 比例进行提取。 ③ 液体样本:若是澄清液体,直接检测,若液体样本浑浊,需 4℃×12000rpm,离心 10min取上清液检测。 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 540nm② 所有试剂解冻至室温(25℃),在 EP 管中依次加入试剂名称(μL测定管 对照管 样本 50 50 试剂一 150 试剂二 150 37℃孵育 60min 试剂三 150 150本试剂盒仅供科研使用 2 混匀,95℃水浴 5min,取出后用自来水或冰水冷却至室温, 200μL 澄清液体于 96 孔板中,在 540nm 处读取吸光值 AΔA=A 测定管-A 对照管(每个样本做一个对照管)。 【注】若ΔA 在零附近如低于 0.005,可增加样本取样质量 W 或增加样本加样体积 V1(如增至 80μL则试剂三相应减少),则改变后的 W V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程为 y = 0.0132x - 0.0545x 为标准品质量(μg),y ΔA2、按照蛋白浓度计算 单位定义:每毫克组织蛋白每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。 内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活力(μg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(Cpr×V1) ÷T =1515.2×(ΔA+0.0545) ÷Cpr 3、按样本鲜重计算 单位定义:每克组织每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。 内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活力(μg/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(W×V1÷V) ÷T =1515.2×(ΔA+0.0545)÷W 4、按细菌/细胞密度计算 单位定义:每 1 万个细菌或细胞每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。 内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活力(μg/h/104 cell)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(500×V1÷V) ÷T =3×(ΔA+0.0545) 5、按液体体积计算 单位定义:每毫升液体每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。 内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活力(μg /h/mL)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷V1÷T =1515.2×(ΔA+0.0545) V---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.05 mLT---反应时间,60 min=1 小时; W---样本质量,g500---细菌或细胞总数,500 万; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒; 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(2mg/mL):从标准品管中称量取出 4mg 至一新 EP 管中,再加 2mL 蒸馏水混匀溶解即 2mg/mL 的葡萄糖(母液需在两天内用且-20℃保存)。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2. mg/mL。也可 根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据对照管的加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。

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