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滤纸酶(FPA)试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-21

简要描述:

滤纸酶(FPA)试剂盒,微板法
纤维素酶是由微生物产生的多组分的酶系,能水解纤维素β-1,4 葡萄糖苷键生成葡萄糖,研究滤纸酶活力对纤维素酶的研究具有非常重要的意义。

滤纸酶(FPA)试剂盒,微板法

滤纸酶(FPA)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 滤纸酶(Filter paper ActivityFPA)试剂盒说明书 (货号:WS5550W 微板法 48 样) 一、产品简介: 纤维素酶是由微生物产生的多组分的酶系,能水解纤维素β-1,4 葡萄糖苷键生成葡萄糖, 研究滤纸酶活力对纤维素酶的研究具有非常重要的意义。 滤纸酶水解滤纸产生的还原糖能与 3,5-二硝基水杨酸生成红棕色氨基化合物,在 540nm 处有最大光吸收,在一定范围内反应液颜色深浅与还原糖的量成正比,可测定计算得滤纸 酶的活力。 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 滤纸条×100 4℃保存 试剂一 液体 80mL×1 4℃保存 试剂二 液体 50mL×1 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、天平、研钵、低温离心机、恒温水浴锅、可调式移液器。 四、滤纸酶(FPA)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 蒸馏水,进行冰浴匀浆。 4×12000rpm 离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取 ② 细菌或培养细胞 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 蒸馏 水,超声波破碎细菌或细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);4×12000rpm 离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照数量(104):提取液体积(mL)500-10001 的比例进行提取 ③ 液体样本:若是澄清液体,直接检测,若液体样本浑浊,需 4×12000rpm,离心 10min取上清液检测。 2、上机检测: 1 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 540nm2 所有试剂至常温(25℃)状态。 3 每个样本需一个自身对照即煮沸样本:样本于 95-100℃水浴锅中煮沸 10min 即可。 4 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 100 100(煮沸样本) 滤纸条 1 1 试剂一 800 800 50℃孵育 60min 试剂二 400 400 混匀,沸水浴(95-100℃5min,冷却至室温本试剂盒仅供科研使用 2 蒸馏水 400 400 混匀,取出 200μL 待检液至 96 孔板中,于 540nm 处读 取吸光值 AΔA=A 测定-A 对照(每个样本做一个样 本自身对照)。 【注】1.A 测定值超过 1.5,可适当对样本进行稀释再检测,或者取 200μL 96 孔板前 行稀释(如吸取 100μL 待检液+100μL 蒸馏水,相当于稀释 2 倍),则相应的稀释倍数 D 需代入计算公式计算。 2. ΔA 差值接近零,可增加样本体积 V1(如增至 200μL,则蒸馏水相应减少,保持总体 积不变)或延长反应时间 T(如增至 2h)或增加取样质量 W,则改变后的 V1 T W 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程为:y = 3.6433x + 0.0016x 是标准品质量(mg),y ΔA2、按照蛋白浓度计算 定义:50℃下,每毫克蛋白每小时分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需酶量为一个酶活单位。 FPA(mg/h/mg prot)=[(ΔA-0.0016)÷3.6433]÷(V1×Cpr)÷T×D=2.74×(ΔA-0.0016)÷Cpr×D 3、按照样本质量计算 定义:50℃下,每克组织每小时分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位。 FPA(mg/h/g)=[(ΔA-0.0016)÷3.6433]÷(W×V1÷V)÷T×D=2.74×(ΔA-0.0016)÷W×D 4、按液体体积计算 定义:50℃下,每毫升液体每小时分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需酶量为一个酶活单位。 FPA(mg/h/mL)=[(ΔA-0.0016)÷3.6433]÷V1÷T×D=2.74×(ΔA-0.0016)×D 5、按细胞数量计算 定义:50℃下,每 104个细胞每小时分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需酶量为一酶活力单位。 FPA(mg/h/104cell)=[(ΔA-0.0016)÷3.6433]÷(V1×细胞数量÷V)÷T×D =2.74×(ΔA-0.0016)÷细胞数量×D V---提取液体积,1mLV1---反应体系中加入样本体积,0.1mLW---样本质量,gT---反应时间,60min=1 小时; D---稀释倍数,未稀释即为 1; Cpr---样本蛋白浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(5mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水(母液需在两天 内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.6, 1.2, 1.8, 2.4, 3. mg/mL。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 100μL 标准品+800μL 试剂一+400μL 试剂二,混匀,沸水浴(95-100℃5min,冷 却至室温,再加 400μL 蒸馏水,混匀后取出 200μL 待检液至 96 孔板中,于 540nm 处读取吸光值 A。根据结果即可制作标准曲线。

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