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几丁质酶试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-20

简要描述:

几丁质酶试剂盒,微板法
多种微生物、动物、植物等都可产生几丁质酶,高等植物本身不存在作为真菌细胞壁
组分之一的几丁质,但当植物受到病原菌感染时,几丁质酶活性迅速提高。因此该酶与
植物对病原微生物的抗性有关,是重要的病程相关蛋白。

几丁质酶试剂盒,微板法

几丁质酶试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 

几丁质酶试剂盒说明书 

(货号:WS6450W 微板法 48 样) 

一、产品简介: 多种微生物、动物、植物等都可产生几丁质酶,高等植物本身不存在作为真菌细胞壁 组分之一的几丁质,但当植物受到病原菌感染时,几丁质酶活性迅速提高。因此该酶与 植物对病原微生物的抗性有关,是重要的病程相关蛋白。 几丁质酶主要水解几丁质多聚体中β-1,4-糖苷键,在蜗牛酶的作用下全部水解为 N- 乙酰氨基葡萄糖单体,进一步与铁氰hua钾反应,于 420nm 处检测,进而计算得到几丁 质酶活性大小。 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 液体 15mL×1 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部, 再加 5mL 盐酸充分混匀溶解后, 再加 5.5mL 蒸馏水混匀备用。 试剂三 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部, 再加 1.2mL 蒸馏水溶解备用。 试剂四 液体 2mL×1 4℃保存 试剂五 液体 5mL×1 4℃保存 试剂六 粉体 g×1 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部, 再加 24mL 蒸馏水溶解备用。 标准品 粉剂×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、天平、水浴锅、低温离心机、盐酸、蒸馏水。 四、几丁质酶活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,于 4℃12000rpm 离心 10min,取上清置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照提取液体积(mL) :组织质量(g)为 15~10 的比例进行提取 ② 真菌样本:先收集细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细胞加入 1mL 提取液; 冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);于 4℃12000rpm 离心 10min,取上清置于冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照提取液(mL):细细胞数量(104)为 1500~1000 的比例进行提取 ③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 420nm② 在 EP 管中依次加入: 试剂名称(µL测定管 对照管 样本 80 煮沸样本 80本试剂盒仅供科研使用 2 试剂一 80 80 试剂二 100 100 混匀,37℃(恒温培养箱)孵育 1.5h4000rpm 离心 5min,取上清 ③ 在 EP 管中依次加入: 上清液 150 150 试剂三 10 10 试剂四 15 15 混匀,37℃孵育 1h 试剂五 50 50 混匀,4000rpm 离心 5min,取上清液待测, ④ 在 EP 管中依次加入: 上清液 150 150 试剂六 200 200 混匀,95-100℃煮沸 10min,取 200µL 96 孔板中于 420nm 处读取 各管吸光值 AΔAA 对照-A 测定(每个样本做一个自身对照)。 【注】1. 煮沸的样本:于 95-100℃煮沸 10min,使样本里面的酶失去活性。 2. ΔA 较小,可以加大样本量(如增至 120µL,则试剂一相应减少),或增加样本取样量 (如增至 0.2g),则改变后的 V1 和样本质量 W 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.0417x + 0.0005X 是标准品质量(μg),y ΔA2、按照样本重量计算: 定义:每克组织每小时分解几丁质产生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。 几丁质酶活(μg/h/g 鲜重)=[(ΔA-0.0005)÷0.0417×2.6]÷(V1÷V×W)÷T=519.6×(ΔA-0.0005)÷W 3、按照蛋白质浓度计算: 定义:每毫克蛋白每小时分解几丁质产生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。 几丁质酶活(μg/h/mg prot)=[(ΔA-0.0005)÷0.0417×2.6]÷(V1×Cpr)÷T=519.6×(ΔA-0.0005)÷Cpr 4、按细胞数量计算: 定义:每 104个细胞每小时分解几丁质产生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。 几丁质酶活(μg/h/104 cell)=[(ΔA-0.0005)÷0.0417×2.6]÷(V1÷V×细胞数量)÷T =519.6×(ΔA-0.0005)÷细胞数量 5、按照液体体积计算: 定义:每毫升液体每小时分解几丁质产生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。 几丁质酶活(μg/h/mL)=[(ΔA-0.0005)÷0.0417×2.6]÷V1÷T=519.6×(ΔA-0.0005) V---提取液体积,1mLV1---样本体积,0.08mLT---反应时间,1.5hW---样本质量,g2.6---体积系数; 标准品分子量---221.21Cpr---样本蛋白浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1mg/mL):标准品临用前加 2mL 蒸馏水,即为 1mg/mL2 把母液稀释成以下浓度:0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1mg/mL本试剂盒仅供科研使用 3 3 依据第④步骤的加样体系:150μL 标准品+200μL 试剂六,混匀,95-100℃煮沸 10min,取 200µL 96 孔板中于 420nm 处读取各管吸光值 A,标准品的质量作为横坐标,0 mg/mL 对应 A 值减去 各浓度标准品对应 A 值之差作为纵坐标,即可得出标准曲线。

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