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NAD激酶(NADK)试剂盒

更新时间:2024-06-20

简要描述:

NAD激酶(NADK)试剂盒
NADK(EC 2.7.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是目前所发现 的生物体内惟一能够催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶

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NAD激酶(NADK)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 NAD 激酶(NAD kinase, NADK)试剂盒说明书 (货号:WS4580F 紫外法 48 样) 一、产品简介: NADKEC 2.7.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中是目前所发现 的生物体内惟一能够催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶,因此,NAD 激酶在合成 NADP(H) 以及调节 NAD(H)NADP(H)的平衡上具有重要作用。 NADK 催化 NAD+磷酸化生成 NADP+;接着在 6-磷酸葡萄糖脱氢酶和 6-磷酸葡萄糖作 用下,使 NADP+还原成 NADPH。通过检测 NADPH 340 nm 下的增加速率。可得出 NADK 酶活性的大小。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 -20℃保存 临用前甩几下或离心使粉剂落 入底部,再加 1.1mL 蒸馏水溶 解。 试剂二 粉剂 mg×1 -20℃保存 临用前甩几下或离心使粉剂落 入底部,再加 1.1mL 蒸馏水溶 解。 试剂三 液体 40mL×1 4℃保存 试剂四 粉剂 mg×1 4℃保存 临用前甩几下或离心使粉剂落 入底部,再加 1.1mL 蒸馏水溶 解。 三、所需的仪器和用品: 紫外分光光度计、1mL 石英比色皿(光径 1cm)、低温台式离心机、可调式移液器、 研钵、蒸馏水。 四、NAD 激酶(NADK)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本 称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。4×12000g 离心 10min,取上 清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取 ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液; 超声波破碎细菌或细胞(冰浴,300W,超声 3s,间隔 7s,重复 30 次); 4×12000g 离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取 ③ 液体样本:直接检测,若浑浊则离心后取上清液检测。 2、上机检测: ① 紫外分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温(25℃) ③ 在 1mL 石英比色皿中依次加入下列试剂:本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称(μL测定管 样本 40 试剂一 20 试剂二 20 试剂三 700 混匀,25℃下孵育 5-10min 试剂四 20 混匀,25℃下立即于 340nm 处读取 A12min 后读 A2A=A2-A1【注】1. 若 A2 值大于 1.5,则可减少样本上样量 V1(如减至 5μL,则试剂三相应增加),或缩短 反应时间 T(如缩至 1min 或更短),则改变后的加样量 V1 和反应时间 T 需代入公式重新计算。 2. 若△A 在零附近徘徊,可增加样本量(如增至 20μL,则试剂三相应减少),或增加反应时 间 T(如增至 5min 或更长)。则改变后的加样量 V1 和反应时间 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、按样本蛋白浓度计算: 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟生成 1μmol NADP+定义为一个酶活力单位。 NADKμmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷ε×d×106]÷(V1×Cpr) ÷T=1.61×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算: 酶活定义:每克组织每分钟生成 1μmol NADP+定义为一个酶活力单位。 NADKμmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V2÷ε×d×106]÷(W× V1÷V) ÷T=1.61×ΔA÷W 3、按细菌/细胞密度计算: 酶活定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1μmol NADP+定义为一个酶活力单位。 NADKμmol/min /104 cell)=[ΔA×V2÷ε×d×106]÷(500×V1÷V) ÷T=0.003×ΔA 4、按液体样本计算: 酶活定义:每毫升液体每分钟生成 1μmol NADP+定义为一个酶活力单位。 NADKμmol/min/mL)=[ΔA×V2÷ε×d×106]÷V1÷T=1.61×ΔA ε---NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cmd---96 孔板光径,1cmV---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.04 mLV2---反应体系总体积 8×10-4 LT---反应时间,2 minW---样本质量,g500---细菌或细胞总数,500 万; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。

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