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ATP含量试剂盒(酶法)

更新时间:2024-06-20

简要描述:

ATP含量试剂盒(酶法)
三磷酸腺苷(ATP)是生物体内能量转换最基本的载体,是生物体内最直接的能量来源, 测定 ATP 含量并且计算能荷,能够反映能量代谢状态。

ATP含量试剂盒(酶法)

ATP含量试剂盒(酶法)

本试剂盒仅供科研使用 1 ATP 含量测定试剂盒说明书 (货号:WS7580F 分光法 48 样) 一、产品简介: 三磷酸腺苷(ATP)是生物体内能量转换最基本的载体,是生物体内最直接的能量来源, 测定 ATP 含量并且计算能荷,能够反映能量代谢状态。 三磷酸腺苷(ATP)在己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶混合酶的作用下,使 ATP 水解 并伴随着 NADPH 的生成,通过检测 340nm NADPH 的增加量,进而计算得到 ATP 含量。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 60mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂×1 4℃保存 临用前甩几下或离心,使粉剂落 入底部,再加 1.1mL 蒸馏水备用。 试剂二 粉剂×1 -20℃保存 临用前甩几下或离心,使粉剂落 入底部,再加 1.1mL 蒸馏水备用。 试剂三 33mL 液体×1 4℃保存 试剂四 粉剂×1 4℃保存 临用前甩几下或离心,使粉剂落 入底部,再加 1.1mL 蒸馏水备用。 三、所需的仪器和用品: 紫外分光光度计、1mL 石英比色皿(光径 1cm)、恒温培养箱、可调式移液枪、研钵 和蒸馏水。 四、ATP 含量检测: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 称取约 0.1g 组织加入研钵中,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,12000rpm4℃离心 10min,取上清液,置冰上待测。 【注】:也可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取 ② 细菌/真菌样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心弃上清;取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液; 冰浴超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3S,间隔 10S,重复 30 次);12000rpm4℃离心 10min,取上清液,置冰上待测。 【注】:也可按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~10001 的比例进行提取 ③ 液体样本:澄清的液体直接检测;若浑浊则离心后取上清检测。 ④ 高蛋白含量样本: -1:称取约 0.1g 组织加入研钵中,加入 1mL 蒸馏水,进行匀浆,转至 EP 管中,于 95℃水浴中煮 5min,取出冷却至室温后于 12000rpm,室温离心 10min,上清液待测。 -2:或称取约 0.1g 组织加入研钵中,加入 0.5mL 高氯酸(0.5M),进行冰浴匀浆, 8000rpm4℃离心 10min,取全部上清至另一 EP 管中,再加入与上步所取上清液等体 积的 KOH NaOH0.5M)混匀,使整个液体 PH 近中性,若澄清直接检测,若浑浊 8000rpm4℃离心 5min 后取上清液测定,此时整个上清液体积记为 V3本试剂盒仅供科研使用 2 2、上机检测① 紫外分光光度计预热 30 min 以上,调节波长到 340nm,蒸馏水调零。 ② 在 1mL 石英比色皿(光径 1cm)中依次加入: 试剂名称(μL测定管 样本 40 试剂一 20 试剂二 20 试剂三 600 混匀,室温(25℃)下,5min后于340nm 处读取A1值。 试剂四 20 混匀,室温(25℃)下,反应15min340nm处读取A2值,ΔA=A2-A1【注】若ΔA 差值在零附近,可增加样本量 V1(如 100μL,则试剂三相应减少)。 则改变后的 V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、按样本鲜重计算: ATP 含量(μmol/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V)=2.78×ΔA÷W 2、按细菌/细胞密度计算: ATP 含量(μmol/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(500×V1÷V)=0.006×ΔA 3、液体中 ATP 含量计算: ATP 含量(μmol/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷V1=2.78×ΔA 4、高蛋白样本中 ATP 含量计算: ATP 含量(μmol/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V)=2.78×ΔA÷W ATP 含量(μmol/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V3)=2.78×ΔA÷V3÷W ε---NADPH的摩尔吸光系数为6.3×103L/mol/cmd---光径距离,1cmV---提取液体积,1mLV1---样本体积,40μL=0.04mLV2---反应总体积,700μL=7×10-4LATP分子量---551.14W---样本质量,g

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