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ATP含量试剂盒

更新时间:2024-06-20

简要描述:

ATP含量试剂盒
三磷酸腺苷(ATP)是生物体内能量转换最基本的载体,是生物体内最直接的能量来源, 测定 ATP 含量并且计算能荷

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本试剂盒仅供科研使用 1 ATP 含量(磷钼酸比色法)测定试剂盒说明书 (货号:WS5180F 分光法 48 样) 一、产品简介: 三磷酸腺苷(ATP)是生物体内能量转换最基本的载体,是生物体内最直接的能量来源, 测定 ATP 含量并且计算能荷,能够反映能量代谢状态。 肌酸激酶催化三磷酸腺苷(ATP)和肌酸生成磷酸肌酸,用磷钼酸比色法进行检测, 经波长扫描产物在 700nm 处有最大吸收峰,进而计算得到 ATP 的含量。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 提取液 A 30mL×1 提取液 B 5mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×2 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉体落入底部,每支 再加入 1.5mL 蒸馏水充分溶解待用;用不 完试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。 试剂二 液体 12mL×1 4℃保存 试剂三 粉剂μg×2 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉体落入底部,再加 1mL 蒸馏水充分溶解待用;用不完的试 剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。 试剂四 粉剂 mg×2 4℃保存 用前甩几下使粉剂落入底部,每瓶依次加 4.3mL 水,再1.7mL 浓硫酸加浓 硫酸时务必小心,逐滴缓慢加入水中,注 意防护)。 试剂五 液体 60mL×1 4℃保存 标准液 粉体 mg×1 -20℃保存 用前准确称取 2mg 粉体即 ATP 至一新 EP 管中,再加 1.7mL 蒸馏水溶解即 2μmoL/mL,再用水稀释一倍成 1μmoL/mL 标准品,待用(-20℃保存,一周内用完)【注】:全程操作需无磷环境;试剂配置最好用新的枪头和玻璃移液器等,也可以用一次性塑料器皿, 避免磷污染。 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、水浴锅、可调式移液枪、研钵。 四、ATP 含量检测: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 称取约 0.1g 组织加入研钵中,加 0.5mL 提取液 A 进行匀浆,转至 EP 管中,于 12000rpm,室温离心 10min,取出 250μL 上清液至一新 EP 管中,再加入适量提取液 B PH 至中性(用 PH 试纸测量,PH 6.5-8 之间均可)。再加蒸馏水定容至 0.5mL该液体待测备用。 【注】:也可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取。 ② 细菌/真菌样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心弃上清;取500万细菌或细胞至研钵中,加0.5mL本试剂盒仅供科研使用 2 提取液 A 进行匀浆,低温超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),于 12000rpm,室温离心 10min,取出 250μL 上清液至一新 EP 管中, 再加入适量提取液 B PH 至中性(用 PH 试纸测量,PH 6.5-8 之间均可)。再加蒸 馏水定容至 0.5mL,该液体待测备用。 【注】:也可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 ③ 液体样本: 澄清样本直接检测,若浑浊则 12000rpm4℃离心 5min 后取上清液测定。 【注】:也可以按照血清(浆)体积(mL):提取液体积(mL)15~10 的比例提取。 2、上机检测① 可见分光光度计预热 30 min 以上,调节波长到 700nm,蒸馏水调零。 反应液配制:按照试剂四:试剂五=15 的比例混匀。用多少配多少的混合液。 ③ 在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL) 测定管 对照管 标准管 (仅做一次) 空白管 (仅做一次) 样本 50 50 标准液 50 试剂一 50 50 试剂二 100 100 100 100 试剂三 30 30 蒸馏水 80 130 充分混匀,37℃准确水浴 30min 反应液 480 480 480 480 混匀,37℃水浴 20min,液体全部转移至 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm中,在 700nm 下读取各管吸光值 A(每个测定管需设一个对照管)。 【注】若 A 测定-A 对照的值小于 0.01,可增加取样质量 W(如增至 0.2g)或增加样本加 样量 V1(如由 50μL 增至 100μL,则试剂二相应减少);标准管仍为 50μL,其他试 剂不变;则改变后的 W V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、按样本鲜重计算: ATP 含量(μmol/g 鲜重)=[C 标准×V ×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)]÷(W×V1÷V) =(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷W 2、按细菌/细胞密度计算: ATP 含量(nmol/104 cell)=[C 标准×V ×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)]÷(500×V1÷V) =2×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白) 3、液体中 ATP 含量计算: ATP 含量(μmol/mL)=[C 标准×V ×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)]÷V1 =(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白) C 标准---标准液浓度,1μmol/mLV---加入提取液体积,1mLV1---加入反应体系中样本体积,0.05mLV ---标准品加样体积,0.05mLW---样本质量,g500---细胞或细菌总数,万。


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