更新时间:2024-06-19
α-木糖苷酶试剂盒 α-木糖苷酶(EC 3.2.1.177)是一类木聚糖降解水解酶,存在于植物、细菌和真菌等生物 体,促使非还原末端α-D-木糖残基的水解,释放出α-D-木糖。
α-木糖苷酶试剂盒
α-木糖苷酶试剂盒
本试剂盒仅供科研使用 1 α-木糖苷酶(α- xylosidase)活性测定试剂盒说明书 (货号:WS3170F 分光法 24 样) 一、产品简介 : α-木糖苷酶(EC 3.2.1.177)是一类木聚糖降解水解酶,存在于植物、细菌和真菌等生物 体,促使非还原末端α-D-木糖残基的水解,释放出α-D-木糖。 α-木糖苷酶催化对硝基*酚-α-D-木糖苷产生对硝基*酚(PNP),该产物在 405nm 处 有特征吸收峰,通过测定 405nm 光吸收增加速率,即可计算α-木糖苷酶活性。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部, 再加 2mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 液体 6mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 液 27mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂×1 支 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、可调式移液器、低温离心机、天平、 研钵、冰和蒸馏水。 四、α-木糖苷酶活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本的制备: ① 组织样本:取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰 浴匀浆。12000rpm,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 比例提取。 ② 细菌或细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细 胞,加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);12000rpm,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例提取。 ③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测: ① 可见分光光度计预热 30min,调节波长至 405nm,蒸馏水调零。 ② 在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL) 测定管 对照管 样本 30 30 试剂一 75 蒸馏水 75 试剂二 135 135 迅速混匀,40℃保温 20min 试剂三 540 540 混匀,取全部澄清液体转移至 1mL 玻璃比色皿中,于 405nm 处测定吸光值 A,ΔA=A 测定-A 对照(每个测定本试剂盒仅供科研使用 2 管需设一个对照管)。 【注】:若ΔA 低于 0.01,可增加样本取样量 V1(如增至 60μL,则试剂三相应减少), 或延长保温时间(如:40min 或更长),或增加样本质量 W,则改变后的 V1 和 T 和 W 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y=0.0194x+0.0028;x 为标准品摩尔质量(nmol),y 为ΔA。 2、按蛋白浓度计算: 定义:40℃下,每毫克蛋白每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(PNP)为一个酶活单位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0028)÷0.0194÷(V1×Cpr)÷T =85.9×(ΔA-0.0028)÷ Cpr 3、按样本质量计算: 定义:40℃下,每克组织每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(PNP)为一个酶活单位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0028)÷0.0401÷(V1÷V×W)÷T =85.9×(ΔA-0.0028)÷W 4、按细胞数量计算: 定义:40℃下,每 104个细胞每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(PNP)为一酶活单位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/104cell)=(ΔA-0.0028)÷0.0401÷(V1÷V×细胞数量)÷T =85.9×(ΔA-0.0028)÷细胞数量 5、按液体体积计算: 定义:40℃下,每毫升液体每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(PNP)为一个酶活单位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0028)÷0.0401÷V1÷T=85.9×(ΔA-0.0028) V---加入提取液体积,1mL; V1---加入反应体系中样本体积,30μL=0.03mL; W---样本质量,g; 500---细胞或细菌总数,500 万; T---反应时间,20min; PNP 对分子质量---139.11; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3 mg/mL。也可根据实 际样本来调整标准品浓度。 3 在 EP 管加入:30μL 标准品+75μL 蒸馏水+135μL 试剂二+540μL 试剂三,混匀,取 全部澄清液体转移至 1mL 玻璃比色皿中,于 405nm 下读取吸光值。 4 根据结果制作标准曲线。