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植物磷酸丙糖异构酶(TPI)试剂盒

更新时间:2024-06-17

简要描述:

植物磷酸丙糖异构酶(TPI)试剂盒
植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶(EC 5.3.1.1, TPI 或 TIM)是光合作用中参与 calvin 循环 的重要酶。磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质,并在其中逐步转化为蔗糖。

植物磷酸丙糖异构酶(TPI)试剂盒

植物磷酸丙糖异构酶(TPI)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 植物磷酸丙糖异构酶(Triose-phosphate isomeraseTPI)试剂盒说明书 (货号:WS4060F 紫外分光法 48 样) 一、产品简介: 植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶(EC 5.3.1.1, TPI TIM)是光合作用中参与 calvin 循环 的重要酶。磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质,并在其中逐步转化为蔗糖。 TPI 转化磷酸二羟丙酮转化为甘油醛 3-磷酸,接着与酶混合物作用,伴随着 NADH 的生 成,通过检测 NADH 340nm 处的增加速率,进而计算出 TPI 酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液一 液体 60mL×1 4℃保存 提取液二 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 液体μL×1 -20℃保存 用前先离心或甩几下使试剂落入底 部,再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解。 试剂二 粉体 mg×1 -20℃保存 用前先离心或甩几下使试剂落入底 部,再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解。 试剂三 液体:40mL×1 4℃保存 试剂四 粉体 mg×1 -20℃保存 用前先离心或甩几下使试剂落入底 部,再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解。 三、所需的仪器和用品: 紫外分光光度计、1mL 石英比色皿(光径 1cm)、可调式移液器、天平、低温离心机、 研钵、震荡仪。 四、磷酸丙糖异构酶(TPI)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实 验样本和试剂浪费! 1、样本制备: TPI酶提取:建议称取约0.1g样本,加入1mL提取液二进行冰浴匀浆,于4℃,13000rpm 离心5min,取上清液测定。 胞浆和叶绿体 TPI 酶的分离: 称取约0.2g样本,加入1mL提取液一,冰浴匀浆后于4℃,1600rpm离心5min,弃沉淀, 取上清在4℃,5000rpm离心15min取上清用于测定胞浆TPI酶活性,沉淀留用。 取上述沉淀加1mL提取液二,强力涡旋震荡15s,置于冰上(或冰箱)孵育15min,在4℃, 13000rpm离心5min,取上清测定叶绿体中TPI酶活性。 【注】:a、测定总 TPI 酶活性,按照步骤提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中 TPI,则按照步骤提取粗酶液。 b、整个叶绿体的提取过程须保持4低温环境。 2、上机检测: ① 紫外分光光度计预热 30min,调节波长至 340nm,设定温度 25℃,蒸馏水调零。 ② 所有试剂刚从冰箱里面拿出需先解冻至室温(25℃)。本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 在 1mL 石英比色皿中依次加入: 试剂名称(μL样本管 样本 40 试剂一 20 试剂二 20 试剂三 600 试剂四 20 轻轻混匀,于 340nm 处检测,10s 读取 A110min 后读取 A2A=A2-A1【注】 若A 在零附近徘徊,可以延长反应时间 T(如 30min),或者加大样本 V1(如增至 80μL,则试剂三相应减少),则改变后的反应时间 T 和样本量 V1 代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、按照样本蛋白浓度计算 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 TPInmol/min/mg prot=[ΔA×V2÷ε×d×109V1×Cpr÷T = 281.4×ΔA÷Cpr 2、按照样本质量计算 酶活定义:每克组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 TPInmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷ε×d×109W ×V1÷V÷T = 281.4×ΔA÷W V---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.04mLV2---反应体系总体积,7×10-4 Ld---光径,1cmε---NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmW---样本质量,gT---反应时间,10minCpr---蛋白浓度(mg/mL),建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。

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