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植物果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)试剂盒

更新时间:2024-06-17

简要描述:

植物果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)试剂盒
植物中的果糖 1,6- 二磷酸醛缩酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA) 是卡尔文循 环(Calvin)中重要的酶,是控制光合作用速率的重要酶之一。

植物果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)试剂盒

植物果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 植物果糖1,6-二磷酸醛缩酶(Fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA试剂盒说明书 (货号:WS3060F 紫外分光法 48 样) 一、产品简介: 植物中的果糖 1,6- 二磷酸醛缩酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA) 是卡尔文循 (Calvin)中重要的酶,是控制光合作用速率的重要酶之一。在植物中有两种在结构上有 一定同源性的果糖 1, 6-二磷酸醛缩酶的异构型,即叶绿体型和胞质型。 FBA 可催化果糖 1,6-二磷酸生成 3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮,在酶促复合物的相继 作用下催化 NADH 和磷酸二羟丙酮生成 NAD α-磷酸甘油,检测 340nm NADH 的下 降速率即可得出 FBA 活性的高低。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液一 液体 50mL×1 4℃保存 提取液二 液体 50mL×1 4℃保存 试剂一 液体μL×1 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部,再加 2.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×4 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部,每支加 0.6mL 蒸馏水溶解,用 不完的试剂分装后-20保存,禁止 反复冻融,三天内用完。。 试剂三 液体μL×1 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部,再加 2.2mL 蒸馏水溶解备用。 试剂四 液体 30mL×1 4℃保存 试剂五 粉剂 mg×1 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部,再加 4.2mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品: 紫外分光光度计、1mL 石英比色皿(光径 1cm)、可调式移液器、天平、震荡仪、低 温离心机、研钵。 四、植物果糖 1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)活性测定: 1、样本制备: FBA酶提取:建议称取约0.1g样本,加入1mL提取液二进行冰浴匀浆,于4℃,13000rpm 离心5min,取上清液测定。 胞浆和叶绿体 FBA 酶的分离: 称取约0.2g样本,加入1mL提取液一,快速冰浴匀浆后于4℃,1600rpm离心5min,弃沉淀, 取上清再4℃,5000rpm离心15min取上清用于测定胞浆FBA酶活性,取沉淀加1mL提取液 二,强力涡旋震荡15s,置于冰上(或冰箱)孵育15min,在4℃,13000rpm离心5min,取上清 测定叶绿体中FBA酶活性。提示:整个叶绿体的提取过程须保持4低温环境。 建议测定总 FBA 酶活性,按照步骤提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 FBA,则按照步骤提取粗酶液。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取 2上机检测: 1 紫外分光光度计预热 30min,调节波长至 340nm,设定温度 25℃,蒸馏水调零。本试剂盒仅供科研使用 2 2 所有试剂解冻至室温(25℃)。 1mL 石英比色皿(光径 1cm)中依次加入: 试剂名称(μL测定管 样本 50 试剂一 40 试剂二 40 试剂三 40 试剂四 480 试剂五 80 轻轻混匀,室温(25℃)条件下,于 340nm 处测 定,2min 时读取 A115min 后读取 A2ΔA=A1-A2【注】1.若△A 值在零附近,可适当延长反应时间 T(如由 15min 增至 25min 后读取 A2),或增 加样本加样体积 V1(如由 50μL 增至 100μL,则试剂四相应减少),则改变后的 T V1 需代入公式重新计算。 2. 若下降趋势不稳定,可以每隔 30S 读取一次吸光值,选取一段线性下降的时间段来参与 计算,相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 3. 若起始值 A1 太大如超过 2(如颜色较深的植物叶片,一般色素较高,则起始值相对会 偏高),可以适当减少样本加样量,则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。 或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 12000rpm, 4℃离心 10min,上清液用于检测。 4. 若△A 值大于 0.5,则需减少反应时间(如由 15min 减至 5min 后读取 A2),或减少样 本量(如由 50μL 减至 20μL,则试剂四相应增加),则改变后的反应时间 T 和样本量 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、按照样本蛋白浓度计算: 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 FBA(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=156.5×ΔA÷Cpr 2、按照样本质量计算: 酶活定义:每克组织每分消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 FBA(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=156.5×ΔA÷W ε---NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd---比色皿光径,1cmV---加入提取液体积,1mLV1---加入样本体积,0.05mLV2---反应体系总体积,0.73mL=7.3×10-4LT---反应时间,15 minW---样本质量,g Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。

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