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二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)试剂盒

更新时间:2024-06-19

简要描述:

二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)试剂盒
核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco,EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一个关键 酶,既控制着CO2的固定,同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流

二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)试剂盒

二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 植物二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)试剂盒 (货号:WS2060F 紫外法 48 样) 一、产品简介: 核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubiscoEC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一个关键 酶,既控制着CO2的固定,同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流,其活性的 大小直接影响着光合速率,初始活性可反映体内酶的活化状态,总活性为体内已活化的酶 加上潜在活化的酶活性。 Rubisco 的催化下,1 分子的核酮糖-15-二磷酸(RuBP)与 1 分子的 CO2结合,产 2 分子的 3-磷酸甘油酸(PGA),在 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的共同作 用下,产生甘油醛-3-磷酸,并使还原型辅酶 INADH)氧化。因此,通过检测 340nm NADH 的下降速率,即可得出 Rubisco 的酶活性大小,为了使 NADH 的氧化和 CO2 的固 定同步。本试剂盒加入了 ATP 再生系统。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 50mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×3 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部,每支分 别加 0.75mL 蒸馏水溶解备用。用不完的试剂 分装后保存,禁止反复冻融,三天内用完。 试剂二 液体μL×1 -20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底部,再分别 2.1mL 蒸馏水溶解备用。用不完的试剂分 装后保存,禁止反复冻融。 试剂三 粉剂 mg×1 4℃保存 试剂四 液体 25mL×1 4℃保存 试剂五 液体 2mL×1 -20℃保存 一次性用不完可分装保存于-20℃【注】本试剂盒仅提供 48 个样本的初始活性检测或者 48 个样本的总活性检测。 三、所需的仪器和用品: 紫外分光光度计、1mL 石英比色皿(光径 1cm)、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、 研钵、冰和蒸馏水。 四、二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织样本,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆,12000rpm4℃10min,取上清,置冰上待测。 【注意】 若样本颜色较深(如植物叶片),可引起起始值 A1 值较大如超过 1.5,可在样本制备过程中 增加除色素步骤:取约 0.2g 组织(水分充足的样本可取 1g),加入 1mL 80%乙醇冰浴匀浆, 12000rpm4℃离心 10min,弃掉色素较深的上清液;以上除色素步骤重复 2 次。最后向离心得到 的沉淀中加入 1mL 提取液,混匀或再次冰浴匀浆,12000rpm4℃离心 10min,取上清置冰上待测。 ② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或 细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 2、上机检测① 紫外分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。本试剂盒仅供科研使用 2 提示:一般以检测初始活性为主。若检测总活性则该试剂盒从可以检测 48 个样本减 少为 24 个样本。 ③ 所有试剂解冻至室温(25℃),在 1mL 石英比色皿(光径 1cm)中依次加入: 试剂名称(μL初始活性测定管 总活性测定管 样本 30 30 试剂一 40 40 试剂二 40 40 试剂三 40 40 试剂四 500 500 试剂五 40 混匀,25℃孵育 15min 40 轻轻混匀,室温(25℃)条件下,于 340nm 处检测,10s(待反应 体系稳定)时读取 A110 min 后读取 A2ΔA=A1-A2【注】1. 初始活性测定管,加完试剂五后立即按照操作说明书检测;总活性测定管于 25℃孵育 10min 后再加试剂五,再按照操作说明书检测; 2. 10s 后反应体系未稳定可延长到 1min 再读值。 3. 若△A 的值在零附近,可适当延长反应时间 T(如由 10min 延长到 20min 后读 A2),或增 加样本加样量 V1(30μL 增至 60μL),则改变后的 T V1 需代入计算公式重新计算。 4. A1 值太大如超过 2(如颜色较深的植物叶片,一般色素较高,则起始值相对会偏高), 可适当减少样本加样量 V1(30μL 减至 10μL),则改变后的 V1 需代入公式重新计算。 5. ΔA 值大于 0.4,则需减少反应时间 T(如减至 5min),则改变后 T 需代入公式重新计算。 6. 若下降趋势不稳定,可以每隔 20S 读取一次吸光值,选取一段线性下降的时间段来参与计 算,相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白在每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 Rubisco 活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=369.8×ΔA÷Cpr 单位定义:每毫克组织蛋白在每分钟内固定 1 nmol CO2定义为一个酶活力单位。 Rubisco 活力(nmol CO2/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷2÷T=184.9×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织在每分钟内氧化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 Rubisco 活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=369.8×ΔA÷W 单位定义:每毫克组织蛋白在每分钟内固定 1 nmol CO2定义为一个酶活力单位。 Rubisco活力(nmol CO2/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷2÷T=184.9×ΔA÷Cpr 3、按细胞数量计算: 单位定义:每 104个细胞每分钟内氧化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 Rubisco 活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=369.8×ΔA÷500 V--加入提取液体积,1 mLV1--加入样本体积,0.03mLd--光径,1cmV2--反应体系总体积,6.9×10-4 Lε--NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cmW--样本质量,g2--每固定 1 nmol CO22 nmolNADH 被氧化; T--反应时间,10min500--细胞数量,万; Cpr--蛋白浓度(mg/mL),建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。


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