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谷草天冬氨酸氨基转氨酶GOTAST试剂盒微板法

更新时间:2024-06-07

简要描述:

谷草天冬氨酸氨基转氨酶GOTAST试剂盒微板法
天冬氨酸氨基转移酶,俗称谷草转氨酶,缩写为 AST 或 GOT(EC 2.6.1.1)广泛存在 于动物、植物、微生物和培养细胞中

谷草天冬氨酸氨基转氨酶GOTAST试剂盒微板法

谷草天冬氨酸氨基转氨酶GOTAST试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 谷草转氨酶/天冬氨酸氨基转氨酶(GOT/AST)试剂盒说明书 (货号:WS4240W 微板法 96 样) 一、产品简介: 天冬氨酸氨基转移酶,俗称谷草转氨酶,缩写为 AST GOTEC 2.6.1.1)广泛存在 于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化可逆转氨基反应,是氨基酸代谢的重要酶。 谷草转氨酶/天冬氨酸氨基转氨酶(GOT/AST)催化天门*氨酸和α-同戊二酸发生转氨基 反应,生成谷*酸和草酰乙酸,草酰乙酸进一步自行脱羧生成丙酮酸;丙酮酸可与 2,4- 二硝基苯肼反应生成 2,4-二硝基*腙,在碱性溶液中显棕红色;通过在 520nm 读取吸光 值并计算出该酶活力大小。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 提取液 液体 100mL×1 4℃保存 试剂一 液体 4mL×1 4℃保存 试剂二 液体 4mL×1 4℃保存 试剂三 液体 40mL×1 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、研钵。 四、谷草转氨酶/天冬氨酸氨基转氨酶(GOT/AST)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、 样本制备: ① 组织样本: 取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm4℃离心 10min,取上 清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):试剂一体积(mL)1:5~10 的比例提取。 ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液, 超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104):提取液体积(mL)500~1000:1 的比例提取。 ③ 血清(浆)样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机测定① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 520nm② 可先做 2 个样本预测定,熟悉操作过程,并依据测出的吸光值 A 是否超出标准曲线的 线性范围来做调整。 3 96 孔板中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 10 试剂一 20 20 混匀,于 37℃孵育 30min 试剂二 20 20 样本 10本试剂盒仅供科研使用 2 混匀,于 37℃孵育 10min 试剂三 200 200 混匀,25℃孵育 10min,于 520nm 处测定吸光值 AA=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。 【注】1.A 测定超过 1.2,可降低样本量 V1(如 5μL,另外 5μL 用蒸馏水补齐,总体积 10μL 保持 不变)。则改变后的加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。 2.A 的值在零附近徘徊,则可增加样本量 V1(如 15μL,则试剂一相应减少),或增加样本 取样质量(W),则改变后的加样体积 V1 和取样质量 W 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.4941x + 0.0039x 为标准品浓度(μmol/mL);y ΔA2、按样本蛋白浓度计算: 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 GOT/AST(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0039)÷0.4941×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =67.5×(ΔA-0.0039)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 酶活定义:每克组织每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 GOT/AST(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0039)÷0.4941×V1]÷(W×V1÷V)÷T×103 =67.5×(ΔA-0.0039)÷W 4、按细菌或细胞密度计算: 酶活定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 GOT/AST(nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0039)÷0.4941×V1]÷(500×V1÷V)÷T×103 =0.135×(ΔA-0.0039) 5、血清(浆)GPT 活力计算: 酶活定义:每毫升血清(浆)每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 GOT/AST(nmol/min/mL)=[(ΔA-0.0039)÷0.4941×V1] ÷V1÷T×103=67.5×(ΔA-0.0039) V---提取液体积,1 mLV1---反应体系中样本体积,0.01mLT---反应时间,30 minW---样本质量,g500---细胞或细菌总数,500 万; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL ;建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(20μmol/mL):加 1mL 蒸馏水溶解标准品,充分混匀。 2 把母液稀释成以下浓度:0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/mL。也可根据实际来调整浓度。 3 10μL 标准品+20μL 试剂一+20μL 试剂二,混匀,于 37℃孵育 10min ;再加 200μL 试剂三,混匀,25℃孵育 10min,于 520nm 处测定吸光值 A,依据结果即可制作标 准曲线。

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