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谷an酰胺酶(GLS)试剂盒

更新时间:2024-06-04

简要描述:

谷an酰胺酶(GLS)试剂盒
谷*酰胺酶(GLS,EC 3.5.1.2)是酰胺酶的一种,催化谷*酰胺水解成谷*和氨, 在氮素代谢中具有重要调控作用,尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。

谷an酰胺酶(GLS)试剂盒

谷an酰胺酶(GLS)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 谷*酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性测定试剂盒说明书 (货号:WS7040F 分光法 48 ) 一、产品简介: 谷*酰胺酶(GLSEC 3.5.1.2是酰胺酶的一种,催化谷*酰胺水解成谷*和氨, 在氮素代谢中具有重要调控作用,尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。 谷*酰胺酶(GLS)催化谷*酰胺水解成 L-谷*酸和氨,利用氨在强碱的环境下与次 氯酸盐和*酚作用,生成水溶性染料靛酚蓝,溶液颜色稳定。其在 630nm 处有特征吸收 峰,通过检测氨增加的速率,即可计算该酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 液体 20mL×1 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×2 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部,每瓶再加 11mL 蒸馏水溶解备用。 试剂三 液体 20mL×1 4℃保存 试剂四 液体 24mL×1 4℃保存 试剂五 液体 12mL×1 4℃保存 试剂六 A:液体 7mL×4 B:液体μL×1 4℃保存 临用前取 60μL B 液进一瓶 A 液中,混匀后 作为试剂六使用。混匀后的试剂六一周内用完。 标准管 液体 mL×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该标曲。 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、台式离心机、可调式移液枪、研钵。 四、谷*酰胺酶(GLS)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实 验样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织(水分足的样本可取 0.2-0.5g),加入 1mL 提取液;进行 冰浴匀浆。12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:也可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取。 ② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细 胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s重复 30 次);12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 ③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 630nm,蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温(25℃),在 EP 管依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 80 80 试剂一 200 200 试剂二 200 试剂三 200 混匀,放入 37℃水浴锅或恒温培养箱中孵育 1h本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二 200 试剂三 200 混匀,室温 12000rpm 离心 10min,上清液待测。 ③ 显色反应:在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 上清液(上步反应) 60 60 蒸馏水 180 180 试剂四 240 240 试剂五 120 120 试剂六 240 240 充分混匀,37℃放置 20min 后,全部液体转移至 1mL 玻璃比色皿 (光径 1cm)中,于 630nm 处读取吸光值 AΔA=A 测定管-A 对照管(每个样本做一个自身对照)。 【注】1. 试剂四和五和六需分开加,不能事先混匀。 2. ΔA 的值较小,可增加 37孵育时间(如增至 2 小时或更长),或在显色阶段增加上清液量 V1(如增至 120μL,则蒸馏水体积相应减少);则改变后的 T V1 需代入计算公式重新计算。 3. A 测定大于 1.8,可减少 37孵育时间(如减至 0.5 小时或更短),或在显色阶段减少上清 液量 V1(如减至 30μL,则蒸馏水体积相应增加);则改变后的 T V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程为 y = 1.2921x - 0.0071x 为标准品质量(μg),y 为吸光值ΔA2、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克蛋白质每小时催化谷*酰胺生成 1μg 氨定义为一个酶活力单位。 GLS(μg/h/mg prot)=(ΔA+0.0071)÷1.2921×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T=110×(ΔA+0.0071)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每小时催化谷*酰胺生成 1μg 氨定义为一个酶活力单位。 GLS(μg/h/g 鲜重)=(ΔA+0.0071)÷1.2921×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T=110×(ΔA+0.0071)÷W 4、按细胞数量计算: 单位定义:每 104个细胞每小时催化谷*酰胺生成 1μg 氨定义为一个酶活力单位。 GLS(μg/h/104 cell)=(ΔA+0.0071)÷1.2921×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T=0.22×(ΔA+0.0071) 5、按照液体体积计算: 单位定义:每毫升液体每小时催化谷*酰胺生成 1μg 氨定义为一个酶活力单位。 GLS(μg/h/mL)=(ΔA+0.0071)÷1.2921×(V2÷V3)÷V1÷T=110×(ΔA+0.0071) V---提取液体积,1mLV1----加入②歩反应体系中样本体积,0.08mLV2---②歩反应体系总体积:0.68mLV3---③歩显色步骤中上清液体积,0.06mLT---反应时间,1hW---样本质量; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 标准品母液(10μg/mL 的氨),把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 2, 4, 6, 8, 10 μg/mL2 按照显色反应阶段的测定管加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。

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