醇酰基转移酶（AAT）活性测定试剂盒

醇酰基转移酶（AAT）活性测定试剂盒

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本试剂盒仅供科研使用 1 醇酰基转移酶（alcohol O-acetyltransferase, AAT）试剂盒说明书 （货号：WS6290F 分光法 24 样） 一、产品简介： 醇酰基转移酶（AAT，EC 2.3.1.84）是酯类化合物生物合成过程中的关键酶，研究表明 该酶活性与果实中酯类化合物的含量呈正相关。 醇酰基转移酶（AAT）催化乙酰 CoA 和醇类化合物生成酯类化合物和 CoA，生成的 CoA 具有还原性并可与 DTNB 作用生成黄色物质，该有色物质在 412nm 处有特征吸收峰，即 可得出 MS 酶活性大小。 反应式：acetyl-CoA+a primary alcohol=CoA+an acetyl ester 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 13mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部， 再加入 1.2mL 蒸馏水溶解备用， 试剂三 液体 1mL×1 支 4℃保存 试剂四 液体 0.5mL×1 支 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、 研钵、冰和蒸馏水 四、醇酰基转移酶（AAT）活性测定： 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min，取上 清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取 液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm 4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃），在 1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 200 试剂一 500 试剂二 40 试剂三 40 混匀，30℃条件下孵育 10min，立即于 412nm 处读取吸光值 A1， 试剂四 20本试剂盒仅供科研使用 2 混匀，30℃条件下反应 15min，立即于 412nm 处读取吸光值 A2，ΔA=A2-A1。 【注】：若ΔA 过小，可以延长反应时间 T（如：30℃条件下孵育 30min 或更长），或增加样本 量 V1（如增至 400μL，则试剂一相应减少）。调整后的 T 或 V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.0188x + 0.0062，x 是标准品质量：μg，y 是ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol 辅酶 A 定义为一个酶活力单位。 AAT(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0062)÷0.0188]÷(V1×Cpr)÷T÷Mr×103=23.1×(ΔA-0.0062)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol 辅酶 A 定义为一个酶活力单位。 AAT (nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0062)÷0.0188]÷(W×V1÷V)÷T÷Mr×103=23.1×(ΔA-0.0062)÷W 4 按细菌或细胞密度计算： 酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol 辅酶 A 定义为一个酶活力单位。 AAT (nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0062)÷0.0188]÷(500×V1÷V)÷T÷Mr×103=0.046×(ΔA-0.0062) V1---加入样本体积，0.2mL； V---加入提取液体积，1mL； T---反应时间，15min； W---样本质量，g； CoA---Mr 分子量，767.5； 500---细胞或细菌总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1mg/mL）：用 1mL 蒸馏水溶解标准品（母液需在两天内用且-20℃ 保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.04, 0.08, 0.12,0.16, 0.2 mg/mL。也可根据 实际样本来调整标准品浓度。 3 依据以下步骤操作，50μL 标准品+130μL 试剂一+20μL 试剂三，根据结果即可制作 标准曲线。