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醇酰基转移酶(AAT)活性测定试剂盒

更新时间:2024-05-27

简要描述:

醇酰基转移酶(AAT)活性测定试剂盒
醇酰基转移酶(AAT,EC 2.3.1.84)是酯类化合物生物合成过程中的关键酶,研究表明该酶活性与果实中酯类化合物的含量呈正相关。

醇酰基转移酶(AAT)活性测定试剂盒

醇酰基转移酶(AAT)活性测定试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 醇酰基转移酶(alcohol O-acetyltransferase, AAT)试剂盒说明书 (货号:WS6290F 分光法 24 样) 一、产品简介: 醇酰基转移酶(AATEC 2.3.1.84)是酯类化合物生物合成过程中的关键酶,研究表明 该酶活性与果实中酯类化合物的含量呈正相关。 醇酰基转移酶(AAT)催化乙酰 CoA 和醇类化合物生成酯类化合物和 CoA,生成的 CoA 具有还原性并可与 DTNB 作用生成黄色物质,该有色物质在 412nm 处有特征吸收峰,即 可得出 MS 酶活性大小。 反应式:acetyl-CoA+a primary alcohol=CoA+an acetyl ester 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 30mL×1 4℃保存 试剂一 液体 13mL×1 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部, 再加入 1.2mL 蒸馏水溶解备用, 试剂三 液体 1mL×1 4℃保存 试剂四 液体 0.5mL×1 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、 研钵、冰和蒸馏水 四、醇酰基转移酶(AAT)活性测定: 1、样本制备: 组织样本: 称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min,取上 清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取 ② 细菌/细胞样本: 先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取 液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 12000rpm 4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 2、上机检测: ① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 412nm,蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温(25℃),在 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)中依次加入: 试剂名称(μL测定管 样本 200 试剂一 500 试剂二 40 试剂三 40 混匀,30℃条件下孵育 10min,立即于 412nm 处读取吸光值 A1试剂四 20本试剂盒仅供科研使用 2 混匀,30℃条件下反应 15min,立即于 412nm 处读取吸光值 A2ΔA=A2-A1【注】:若ΔA 过小,可以延长反应时间 T(如:30℃条件下孵育 30min 或更长),或增加样本 V1(如增至 400μL,则试剂一相应减少)。调整后的 T V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.0188x + 0.0062x 是标准品质量:μgy ΔA2、按样本蛋白浓度计算: 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol 辅酶 A 定义为一个酶活力单位。 AAT(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0062)÷0.0188]÷(V1×Cpr)÷T÷Mr×103=23.1×(ΔA-0.0062)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 酶活定义:每克组织每分钟催化产生 1nmol 辅酶 A 定义为一个酶活力单位。 AAT (nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0062)÷0.0188]÷(W×V1÷V)÷T÷Mr×103=23.1×(ΔA-0.0062)÷W 4 按细菌或细胞密度计算: 酶活定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol 辅酶 A 定义为一个酶活力单位。 AAT (nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0062)÷0.0188]÷(500×V1÷V)÷T÷Mr×103=0.046×(ΔA-0.0062) V1---加入样本体积,0.2mLV---加入提取液体积,1mLT---反应时间,15minW---样本质量,gCoA---Mr 分子量,767.5500---细胞或细菌总数,500 万; Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1mg/mL):用 1mL 蒸馏水溶解标准品(母液需在两天内用且-20保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.04, 0.08, 0.12,0.16, 0.2 mg/mL。也可根据 实际样本来调整标准品浓度。 3 依据以下步骤操作,50μL 标准品+130μL 试剂一+20μL 试剂三,根据结果即可制作 标准曲线。

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