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磷脂酶D(PLD)试剂盒

更新时间:2024-05-27

简要描述:

磷脂酶D(PLD)试剂盒
磷脂酶 D(EC 3.1.4.4)即磷脂酰*碱水解酶,是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称,广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中,具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁迫等生理功能。

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磷脂酶D(PLD)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 磷脂酶 DPhospholipases DPLD)活性测定试剂盒说明书 (货号:WS5290F 分光法 24 样) 一、产品简介: 磷脂酶 DEC 3.1.4.4)即磷脂酰*碱水解酶,是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的 一类酶的总称,广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中,具有参与细胞脂质代谢、 信号传导、生物膜形成的抗逆境胁迫等生理功能。 磷脂酶 D 催化水解底物 O-(4-硝基苯基)*碱(NPPC),并在外加酸性磷酸酶的作用下产 生对硝基*酚(PNP),该产物在 405nm 处有最大吸收峰。通过检测 PNP 405nm 下的增加 速率,即可得到 PLC 酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 30mL×1 4℃保存 用前摇匀再用。 试剂一 粉剂 mg×2 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部,每支加 0.3mL 蒸馏水溶解备 用。用不完的试剂-20℃保存。 试剂二 粉剂 mg×1 -20℃保存 用前甩几下使粉剂落入底部,加 1.2mL 蒸馏水溶解且 5000rpm 5min,取上清液备用。用不完 的上清液-20℃保存。 试剂三 液体 30mL×1 4℃保存 试剂四 液体 4mL×1 4℃保存 标准品 粉剂×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、低温离心机、水浴锅或恒温培养箱、 可调式移液器和蒸馏水。 四、磷脂酶 DPLD)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实 验样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:取约 0.1g 组织(水分充足的果实样本可取 0.2-0.3g),加入 1mL 提取液(用 前摇匀再用),进行冰浴匀浆,13000rpm4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取。 ② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细 胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s重复 30 次);13000rpm 4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 2、上机检测: ① 可见分光光度计预热 30min,调节波长到 405nm,蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温(25℃),在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 105 105 试剂一 20 试剂二 20 20本试剂盒仅供科研使用 2 试剂三 485 505 混匀,37℃孵育反应 30min试剂四 70 70 混匀,取全部液体至 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)中, 405nm 处读吸光值 AA=A 测定-A 对照(每个样本 需做一个自身对照)【注】:A 的值小于 0.01,可增加样本量 V1(如增至 60μL,则试剂三相应减少)或延长反应时 T(如增至 60min 或更长),则改变后的 V1 T 须代入公式重新计算。 A 的值超过 1,可减少样本量 V1(如减至 10μL,则试剂三相应增加)或缩短反应时间 T(如减至 10min);或对最终的待检液用蒸馏水稀释,则改变后的 V1 T 和稀释倍数 D 代入计算公式; 五、结果计算: 1、标准曲线:y = 0.0233x - 0.0109x PNP 摩尔质量(nmol)y 是△A2按照样本蛋白浓度计算: 酶活定义:37℃中每毫克蛋白每分钟水解 1nmol NPPC 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。 PLD (nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0109)÷0.0233]÷(Cpr×V1)÷T×D=13.6×(ΔA+0.0109)÷Cpr×D 3按照样本质量计算: 酶活定义:37℃中每克组织每分钟水解 1nmol NPPC 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。 PLD (nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0109)÷0.0233]÷(W×V1÷V)÷T×D =13.6×(ΔA+0.0109)÷W×D 4、按细菌/细胞数量计算: 酶活定义:每 104个细胞每分钟水解 1nmol NPPC 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。 PLD (nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0109)÷0.0233]÷(500×V1÷V)÷T×D=0.03×(ΔA+0.0109)×D 5、按液体体积计算: 酶活定义:37℃中每毫升液体每分钟水解 1nmol NPPC 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。 PLD (nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0109)÷0.0233]÷V1÷T×D=13.6×(ΔA+0.0109)×D V---提取液体积,1 mLV1---加入反应体系中上清液体积(mL),0.105mLT---反应时间(min),30 minD---稀释倍数,未稀释即为 1W ---样品质量,g500---细胞数量; Cpr---粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),建议使用本公司的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒; 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(10μmol/mL):向标准品 EP 管里面加入 1.4ml 蒸馏水超声溶解。 2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 μmol/mL。也 可根据实际样本来调整标准品浓度。 3 EP 管中依次加入:105μL 标准品+525μL 试剂三+70μL 试剂四,混匀取全部液体 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)中,于 405nm 处读值,根据结果即可制作标准曲线。

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