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几丁质外切酶试剂盒

更新时间:2024-05-20

简要描述:

几丁质外切酶试剂盒
多种微生物、动物、植物等都可产生几丁质酶,高等植物本身不存在作为真菌细胞壁
组分之一的几丁质,但当植物受到病原菌感染时,几丁质酶活性迅速提高。因此该酶与
植物对病原微生物的抗性有关,是重要的病程相关蛋白。

几丁质外切酶试剂盒

几丁质外切酶试剂盒说明书 

(货号:WS7450F 分光法 24 样)

一、产品简介: 多种微生物、动物、植物等都可产生几丁质酶,高等植物本身不存在作为真菌细胞壁 组分之一的几丁质,但当植物受到病原菌感染时,几丁质酶活性迅速提高。因此该酶与 植物对病原微生物的抗性有关,是重要的病程相关蛋白。 几丁质酶主要水解几丁质多聚体中β-1,4-糖苷键。依据水解位置的不同可分为几丁质 内切酶和几丁质外切酶,几丁质外切酶作用于几丁质后,生成 N-乙酰氨基葡萄糖单体, 进一步与铁氰化jia反应,于 420nm 处检测,进而计算得到几丁质外切酶活性大小。 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 30mL×1 4℃保存 试剂一 液体 7mL×1 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部, 再加 2.5mL 盐酸充分混匀溶解 后,再加 2.8mL 蒸馏水混匀备用。 试剂三 液体 14mL×1 4℃保存 试剂四 粉体 g×1 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部, 再加 30mL 蒸馏水溶解备用。 标准品 粉剂×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、天平、水浴锅、低温离心机、盐酸四、几丁质外切酶活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,于 4℃,12000rpm 离心 10min,取上清置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照提取液体积(mL) :组织质量(g)为 15~10 的比例进行提取 ② 真菌样本:先收集细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细胞加入 1mL 提取液; 冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);于 4℃, 12000rpm 离心 10min,取上清置于冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照提取液(mL):细细胞数量(104)为 1500~1000 的比例进行提取 2、上机检测: ① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 420nm,蒸馏水调零。 ② 在 EP 管中依次加入: 试剂名称(µL测定管 对照管 样本 120 煮沸的样本 120 试剂一 80 80 试剂二 100 100 混匀,37℃(恒温培养箱)孵育 1.5h ,4000rpm 离心 5min,取上清本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 在 EP 管中依次加入: 上清液 200 200 试剂三 270 270 混匀,4000rpm 离心 5min,取上清液待测 ④ 在 EP 管中依次加入: 上清液 360 360 试剂四 480 480 混匀,95-100℃煮沸 8min,取全部液体至 1mL 比色皿中于 420nm 读取各管吸光值 AΔAA 对照-A 测定(每个样本做一个自身对照)。 【注】1. 煮沸的样本:于 95-100℃煮沸 10min,使样本里面的酶失去活性。 2. ΔA 较小,可以加大样本量(如增至 140µL,则试剂一相应减少),或增加样本取样量 (如 0.2g),则改变后的 V1 和样本 W 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、 标准曲线方程:y = 0.0248x + 0.0024X 是标准品质量(μg),y ΔA2、按照样本重量计算: 定义:每克组织每小时分解几丁质产生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。 几丁质外切酶活性(μg/h/g 鲜重)=[(ΔA-0.0024)÷0.0248×1.96]÷(V1÷V×W)÷T =439.1×(ΔA-0.0024)÷W 3、按照蛋白质浓度计算: 定义:每毫克蛋白每小时分解几丁质产生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。 几丁质外切酶活性(μg/h/mg prot)=[(ΔA-0.0024) ÷0.0248×1.96]÷(V1×Cpr)÷T =439.1×(ΔA-0.0024)÷Cpr 4、按细胞数量计算: 定义:每 104个细胞每小时分解几丁质产生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。 几丁质外切酶活性(μg/h/104 cell)=[(ΔA-0.0024) ÷0.0248×1.96]÷(V1÷V×细胞数量) =439.1×(ΔA-0.0024)÷细胞数量 V---加入提取液体积,1mLV1---样本体积,0.12mLT---反应时间,1.5h1.96---体积系数; W---样本质量,g标准品分子量---221.21Cpr---样本蛋白浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1mg/mL):标准品临用前加 2mL 蒸馏水,即为 1mg/mL2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1mg/mL3 依据第④步骤的加样体系:360μL 标准品+480μL 试剂六,混匀,95-100℃煮沸 10min,取全部液 体至 1mL 比色皿中于 420nm 处读取各管吸光值 A,标准品的质量作为横坐标,0 mg/mL 对应的 A 值减去各浓度标准品对应的 A 之差作为纵坐标,即可得出标准曲线。

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