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葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)试剂盒

更新时间:2024-05-20

简要描述:

葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)试剂盒
我公司所销售的ELISA试剂盒,品种多,质量好,灵敏度高,涉及的品牌有美国原装/分装等不同价格档次的盒子。
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葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)试剂盒

葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用

 葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)活性测定试剂盒说明书

(货号:WS7550F 分光法 48

一、产品简介: 葡萄糖-6-磷酸酶((glucose 6 phosphataseG6PaseEC 3.1.3.9)主要存在于肝脏、肾 脏、 小肠粘膜细胞、胰岛细胞中,催化 6-磷酸葡萄糖水解为葡萄糖的关键酶,该反应是糖原 分解和糖异生的最后一步反应。在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。 本试剂盒提供一种简单,灵敏,快速的测定方法:G6Pase 催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄 糖,变旋酶和葡萄糖脱氢酶进一步依次催化 NAD+还原生成 NADHNADH 与一种显色 探针反应生成有色物质,通过检测该有色物质的增加速率即可计算出 G6Pase 酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 4℃保存 用前甩几下使粉剂落入底部, 再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解, 试剂二 粉剂 mg×1 -20℃保存 用前甩几下使粉剂落入底部, 再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解, 试剂三 液体μL×1 -20℃保存 用前甩几下使液体落入底部, 再加 1mL 蒸馏水充分溶解, 试剂四 液体 1mL×1 4℃保存 试剂五 液体 34mL×1 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 -20℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、台式离心机、可调式移液器、研钵、 冰和蒸馏水。 四、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取 ② 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌 或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间 10s,重复 30 次);12000rpm 4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。 2、上机检测① 可见分光光度计预热 30min 以上,设置温度 25,调节波长至 450nm,蒸馏水调零。 ② 试剂解冻至室温(25℃);若一次检测样本数较多,可将试剂一和二和三等比例混匀 后再一起加 60μL,其他试剂加样量不变 ③ 在 1mL 玻璃比色皿中依次加入: 试剂名称(μL测定管 样本 40 试剂一 20本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二 20 试剂三 20 试剂四 20 试剂五 680 混匀,25℃条件下,立即于 450nm 处读取 A1 值,20min 后读取 A2 值,(观察:酶活性 越大,则黄色越明显)。ΔA=A2-A1【注】1.ΔA 过小,可以延长反应时间(如:60min 或更长)再读取 A2或增加样本加样体积 V1(如增至 70μL,则试剂五相应减少),则改 变后的反应时间 T 和加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。 2.若样本自身含有较高水平葡萄糖,为了消除样本自身的背景值,需增设一个样本 自身对照,即对照管换成 40μL 的煮沸样本(95-100煮沸 10min,室温离心,取上 清液测定),其他不变。ΔA= A2 测定- A2 对照。 五、结果计算: 1、标准曲线:y = 0.03x - 0.0017x NADH 摩尔质量(nmol),y ΔA2、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每分钟催化 1 nmolNAD+生成 1nmol NADH 定义为一个酶活单位。 G6Pase(nmol/min /mg prot)=[(ΔA+0.0017)÷0.03]÷(V1×Cpr)÷T=41.67×(ΔA+0.0017)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每分钟催化 1 nmolNAD+生成 1nmol NADH 定义为一个酶活单位。 G6Pase(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0017)÷0.03]÷(W×V1÷V)÷T=41.67×(ΔA+0.0017)÷W 4、按细菌或细胞密度计算: 单位定义:每 1 万个细胞/细胞每分钟催化 1nmolNAD+生成 1nmol NADH 定为一个酶活单位。 G6Pase(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0017)÷0.03]÷(500×V1÷V)÷T=0.08×(ΔA+0.0017) V----加入提取液体积,1 mLV1----加入样本体积,0.04mLW----样本质量,gT----反应时间,20 minCpr----样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1nmol/μL):向标准品 EP 管里面加入 1.41mL 蒸馏水(母液需在 两天内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 按照 40μL 标准品+20μL 试剂四+680μL 试剂五加样体系操作,根据结果即可制作标 准曲线。

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