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糖原磷酸化酶b(GPb)试剂盒

更新时间:2024-05-20

简要描述:

糖原磷酸化酶b(GPb)试剂盒
我公司所销售的ELISA试剂盒,品种多,质量好,灵敏度高,涉及的品牌有美国原装/分装等不同价格档次的盒子。
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糖原磷酸化酶b(GPb)试剂盒

糖原磷酸化酶b(GPb)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 

糖原磷酸化酶 bGPb)试剂盒说明书 

(货号:WS5650F 分光法 24 样) 一、产品简介: 糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylaseGPEC 2.4.1.1))是糖原分解代谢的关键酶, 使糖原分子从非还原端逐个断开α-14-糖苷键移去葡萄糖基,释放 1-磷酸葡萄糖,直至临 近糖原分子α-16-糖苷键分支点前 4 个葡萄糖基处。GP 分为有活性的糖原磷酸化酶 aGPa和无活性的糖原磷酸化酶 bGPb)两种形式。GPb 在一定浓度的腺苷酸(5-AMP)存在 下可被激活。 本试剂盒提供一种快速,灵敏和简便的检测方法,GP 催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基 生成糖原和 1-磷酸葡萄糖,磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化 NADP+还原 NADPH,接着与特异显色剂反应生成有色物质,通过检测该有色物在 450nm 的增加速率, 进而计算出 GP 酶活性大小。添加一定浓度的腺苷酸(5-AMP)时测定 GPGPa GPb活性,未添加腺苷酸(5-AMP)时测定 GPa 活性,GP 活性-GPa 活性得到 GPb 活性。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,再加 1.2mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×1 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂三 粉剂 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂四 液体 2mL×1 4℃保存 试剂五 液体 32mL×1 4℃保存 试剂六 粉剂 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,再加 2.4mL 蒸馏水充分溶解备用。 标准品 粉剂 mg×1 -20℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、水浴锅、台式离心机、可调式移液 器、研钵、冰。 四、糖原磷酸化酶 bGPb)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min,取上 清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取 ② 细胞样本: 先收集细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细胞加入 1mL 提取液;超声波破 碎细胞(冰浴,功率 20%200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);4ºC 12,000rpm 离心 10min,取上清作为待测样品。 【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~10001 的比例进行提取。本试剂盒仅供科研使用 2 2、上机检测① 可见分光光度计预热 30min 以上,设置温度 30℃,调节波长至 450nm,蒸馏水调零。 ② 试剂放在 30℃水浴 5min③ 在 1mL 玻璃比色皿中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 样本 40 40 试剂一 40 试剂二 20 20 试剂三 20 20 试剂四 40 40 试剂五 600 640 混匀,30℃条件下孵育 10min 试剂六 40 40 混匀,30℃条件下,2min 时立即于 450nm 处读取吸光值 A,△A=A 测定-A 对照(每个样本需做一个样本自身对照)。 【注】:1. ΔA 过小,可以延长反应时间 T(如:10min 或更长)再读取 A2,或增加样本量 V1(如增 80μL,则试剂五相应减小),重新调整的反应时间 T V1 需代入计算公式重新计算。 2. A 测定值大于 1.5,可缩减反应时间 T(如:1min 或更短)再读取 A2,或减少样本量 V1(如 减至 20μL,则试剂五相应增加),重新调整的反应时间 T V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y = 0.0317x-0.0095x 是标准品摩尔质量:nmoly ΔA2、按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每分钟使 1nmol NADP+转换成 1nmol NADPH 为一个酶活单位。 GPbnmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0095) ÷0.0317]÷ (V1×Cpr) ÷T=394.3×(ΔA+0.0095)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每分钟使 1nmol NADP+转换成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 GPbnmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0095) ÷0.0317]÷(W×V1÷V) ÷T=394.3×(ΔA+0.0095)÷W 4、按细胞数量计算: 单位定义:每 104个细胞每分钟使 1nmol NADP+转换成 1nmol NADPH 为一个酶活力单位。 GPbnmol/min/104 cell)= [(ΔA+0.0095) ÷0.0317]÷(500×V1÷V)÷T=0.79×(ΔA+0.0095) V---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.01 mLW---样本质量,gT---反应时间,2 minCpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(1nmol/μL):向标准品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸馏水(母液需在两 天内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 nmol/μL。也可根据实 际样本来调整标准品浓度。 3 依据加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。

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