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蔗糖合成酶SS-I(分解方向)试剂盒,微板法

更新时间:2024-05-22

简要描述:

蔗糖合成酶SS-I(分解方向)试剂盒,微板法
蔗糖是叶片等光合产物向各器官运输的主要形态。蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, EC2.4.1.13)是双向反应酶,既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解,是蔗糖代谢的关键酶之一。

蔗糖合成酶SS-I(分解方向)试剂盒,微板法

蔗糖合成酶SS-I(分解方向)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 蔗糖合成酶(分解方向;SS-Ⅰ)试剂盒说明书 (货号:WS3150W 微板法 48 样) 一、产品简介: 蔗糖是叶片等光合产物向各器官运输的主要形态。蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13)是双向反应酶,既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解,是蔗糖代谢的关键酶之 一。研究其分解方向 SS-Ⅰ的活性对于植物蔗糖降解以及淀粉合成具有重要意义。 SS-Ⅰ催化蔗糖和UDP生成游离果糖和UDPG,采用3,5-二硝基水杨酸法在540nm测定果 糖的含量来反映酶活性的高低。 二、测试盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 4℃保存 试剂一 A:液体 1.1mL×2 B:粉体 mg×2 4℃保存 临用前一支 A 液全部转移至一 B 粉体中,溶解待用, -20℃保存。 -20℃保存 试剂二 液体 1.5mL×1 4℃保存 试剂三 液体 6mL×1 棕色瓶 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、移液器、蒸馏水。 四、蔗糖合成酶(分解方向;SS-Ⅰ)活性检测: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 称取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,在 4ºC 或冰浴进行 匀浆(或使用各类常见电动匀浆器)12,000rpm4ºC 离心 10min,取上清作为待测样品。 【注意】 若样本含糖量高,可引起 A 对照值较大如超过 1.6,即检测背景值过高会影响检测,可在样本 制备过程中增加除糖步骤:取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 经预冷的 95%乙醇 冰浴匀浆,4℃放置 10min12000rpm4℃离心 5min;弃上清,留沉淀,向沉淀中加入经预冷的 80% 乙醇混匀,4℃放置 5min12000rpm4℃离心 5min;弃上清,留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 经预冷 提取液涡旋混匀,4℃放置 10min12000rpm4℃离心 10min;留上清,弃沉淀。上清液置冰上待测。 ② 液体样本:直接测定。 若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 540nm② 在 EP 管中依次加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 试剂一 40 蒸馏水 40 样本 10 10 37℃准确水浴 30min 后,95℃水浴 5min 试剂二 10 10 试剂三 50 50 95℃水浴 10min(可用封口膜缠紧,防止水份散失),本试剂盒仅供科研使用 2 取出后冰浴或淋浴至室温 蒸馏水 200 200 混匀,取 200μL 96 孔板中,540nm 下测定各管吸光值。 ΔA=A 测定管-A 对照管(每个测定管都需设一个对照管)。 【注】:1. ΔA 值过小如在零附近徘徊,可增加样本的加样体积 V1(如 20μL,则蒸馏水相应减少) 或增加样本取样量 W(如增至 0.2g),或者延长 37℃水浴时间 T(如 40min 或更长),相 应的变量重新代入计算公式计算。 2. A 测定的值大于 1.5,则可对加入 96 孔板前的的液体用蒸馏水稀释,则稀释倍数 D 代入计算公式计算。 五、结果计算: 1、标准曲线:y = 0.0128x - 0.0324x 为标准品质量(μg),y ΔA2、按照蛋白浓度计算: 单位定义:每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1 μg 果糖定义为一个酶活力单位。 SS-Ⅰ活性(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0324)÷0.0128]÷(V1×Cpr)÷T ×D =260.42×(ΔA+0.0324) ÷Cpr×D 3、按照样本鲜重计算: 单位定义:每克组织每分钟催化产生 1 μg 果糖定义为一个酶活力单位。 SS-Ⅰ活性(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0324)÷0.0128]÷(W×V1÷V)÷T×D =260.42×(ΔA+0.0324)÷W×D 4、按照液体体积计算: 单位定义:每毫升液体每分钟催化产生 1 μg 果糖定义为一个酶活力单位。 SS-Ⅰ活性(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0324)÷0.0128]÷V1÷T×D =260.42×(ΔA+0.0324)×D V---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.01 mLT---反应时间,30 minW---样本质量,gD---稀释倍数,未稀释即为 1Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1 制备标准品母液(10mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水(母液需在两天 内用且-20℃保存)。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 2, 4, 6, 8, 10. mg/mL。也可根据实际样本来 调整标准品浓度。 3 依据对照管加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。

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