Super Fluor 680 琥珀酰亚胺酯

Super Fluor 680 琥珀酰亚胺酯

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1.4.3.1 装填柱层析分离吸附柱

1) 提前用去离子水浸泡葡聚糖Sephadex过夜(1g 配5mLH2O)，使其溶胀，打开孔状结构。

2) 湿法装柱：装填过程中确保PBS（10mM, pH=7.4）液面比Sephadex高，以防混入空气而产生气泡。先在柱子（13×100mm）内注入3/4左右的PBS，而后加入Sephadex /PBS溶液；分批次、缓慢加入柱子内，后用塑料滴管吸取，沿着柱子四壁旋转，逐步、缓慢地加入，装填至近满，留下约3cm的空间以待注入荧光标记蛋白溶液。

3) 在装填的整个过程中打开活塞（淋出液用大烧杯承接），同时用玻璃棒+橡胶塞从下到上轻轻敲打柱子，使Sephadex装填紧密，注意使柱子内不得有气泡，不得有断层，使柱子竖直，确保顶部端面水平；故滴加Sephadex时应旋转加入，不得直接滴加，以免激起柱顶层。

4) 装填完柱子后，用塑料滴管吸取PBS，沿管口四壁旋转着缓慢加入，使PBS过一遍柱子，而后将PBS注入Sephadex顶部，以隔绝空气，以免在柱内产生气泡，关闭末端活塞。

1.4.3.2 过柱层析分离吸附柱（避光）

1) 打开柱子末端活塞，缓慢放出柱子顶层的PBS，待PBS液面刚与Sephadex柱子端面相平时，立即关闭活塞；注意：不要使PBS液面低于Sephadex柱子端面，以免混入空气而在柱子内产生气泡；立即用塑料滴管吸取荧光蛋白溶液，沿柱子四壁旋转缓慢加入（全部加完）。不要搅动Sephadex ，随时保持其端面水平。